维甲酸诱导分化对SH-SY5Y细胞阿片受体表达的影响

边佳明，吴 宁，李 锦

(1.北京军区总医院药理科 北 京 100700;2.军事医学科学院，毒物药物研究所 北京 100850)

人神经母细胞瘤是起源于胚胎期神经嵴细胞的一种儿童常见恶性肿瘤，SH-SY5Y细胞株即来源于该肿瘤细胞，是一种分化程度较低的肿瘤细胞［1］。该细胞繁殖较慢，细胞形态、生理和生化功能与正常神经细胞相似，被广泛应用于神经系统疾病发病机制和药物作用机制方面的研究。该细胞表面表达有内源性的阿片受体，其数量接近神经组织［2］，因此该细胞系被广泛用于体外细胞水平阿片依赖研究的模型。维甲酸(retinoic acid，RA)可诱导该细胞向神经元形态分化，且以全反式维甲酸(all-trans RA)诱导分化能力最强［3］。吗啡急性激动阿片受体后抑制腺苷酸环化酶(AC)，而这一效应可在RA诱导该细胞向神经元形态分化后得到增强［4］，可能与分化后细胞的阿片受体表达量的改变有关。本研究采用放射性配体受体结合实验确定阿片受体表达量，为合理使用SH－SY5Y细胞系提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 RA(all-trans)，纳洛酮，苯甲基磺酰氟(PMSF)等购自 Sigma-Aldrich(美国)，3H-diprenorphine(50Ci/10－6mol·L－1)购自 NEN(美国)，GF/C玻璃纤维滤纸购自Whatman(美国)，其余所用化学试剂均为分析纯。

1.2 细胞培养和诱导分化 SH-SY5Y细胞购自中国医学科学院细胞中心，维持于含10% 胎牛血清(FBS)，1 ×105IU·L－1青霉素，100 mg·L－1链霉素的 DMEM/F12培养基(GibcoTM，美国)中，37℃，5%CO2培养。取生长良好的细胞置25 cm2培养瓶培养，80%汇片后1∶3传代，随即分为对照组和诱导分化组，对照组给予含等量DMSO的培养基培养，诱导分化组给予含1×10－5mol·L－1终浓度RA的培养基培养。连续分化6 d，每2天换液一次。第7天镜下观察细胞分化情况，进行实验研究。

1.3 放射性配体受体结合实验 细胞膜蛋白提取参照文献［5］进行，考马斯亮蓝法测定膜蛋白浓度。反应体系 5×10－4L，［3H］Diprenorphine终浓度梯度为 2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 × 10－9mol·L－1，纳洛酮终浓度为 1 ×10－5mol·L－1，反应体系用5 ×10－5mol·L－1Tris缓冲液(pH=7.4)配_制，每管膜蛋白4×10－5g。37°C孵育30 min后立即冰水浴终止反应，迅速抽滤3次，取下滤纸烤干，加入闪烁液，隔夜用β液闪仪记录放射强度。特异结合量=总结合量－非特异结合量。

2 结果

2.1 RA诱导后SH-SY5Y细胞向神经元分化RA诱导分化6天后，SH-SY5Y细胞形态变化明显。与对照组细胞(Fig 1A)相比，诱导分化组细胞(Fig 1B)更加圆润，细胞突起明显增多，增长，形成轴突样神经纤维，且构成网络状结构，表明低分化的SHSY5Y细胞正在向成熟神经元方向分化。诱导分化6 d后的细胞计数发现，诱导分化组细胞数明显低于对照组(Fig 2)，约为同步对照细胞数量的25%左右。

Fig 1A Appearance of control cells under microscope(×20)Fig 1B Appearance of RA-induced cells under microscope(×20)

Fig 2 SH-SY5Y cells count at 6th day after differentiation induction by RA

2.2 RA诱导后SH-SY5Y细胞阿片受体表达上调受体结合饱和试验结果显示，与对照细胞比较，RA诱导分化后SH-SY5Y细胞阿片受体表达明显上调。饱和曲线拟合后，两组细胞膜阿片受体表达量(Bmax)存在极明显差异，RA连续诱导分化6天后阿片受体表达量增加了约1.68倍;两组细胞Kd值比较无显著差异，表明受体亲和力未受RA诱导分化的影响(Tab 1)。

Tab 1 Saturated binding fitting parameters of［3H］-diprenorphine

3 讨论

阿片受体分布广泛，在镇痛和依赖研究中具有十分重要的地位，其中对μ阿片受体的研究最为广泛和深入。基因敲除实验证实，μ阿片受体的表达对于镇痛、躯体依赖和精神依赖等生理病理过程是必须的［6］。阿片受体偶联Gi/o蛋白，受体激活导致部分亚型AC活性受抑制，cAMP合成减少，PKA活性下降;而阿片受体的长期激活则导致AC超敏，突然中止对受体的激动，如纳洛酮催促的戒断，则导致cAMP反跳性增高，又称之为cAMP超射，这一现象被普遍认为是阿片依赖的机制之一［7］。

SH-SY5Y细胞是阿片依赖研究中常使用的一种细胞系，原生表达μ阿片受体，且受体表达量与真实脑组织的表达量类似［2］。RA可以诱导 SHSY5Y细胞向神经元分化，但分化后μ阿片受体的表达如何变化还少有研究，这对于在阿片依赖研究中合理使用SH-SY5Y细胞非常重要。利用RA我们成功诱导了SH-SY5Y细胞向神经元分化，表现为细胞突起增多增长，形成轴突样神经纤维，并且细胞间的神经纤维交错成为网状结构。RA诱导分化组细胞的生长明显较对照组细胞减慢，提示RA抑制了细胞的增殖，这一点也被国内王希华等［8］的研究所证实，而RA本身并无促凋亡作用。佟海侠等［9］也发现，维甲酸诱导SH-SY5Y可以明显导致细胞形态出现神经元样改变，且神经营养因子受体表达上调，诱导向成熟神经元方向分化，细胞生长速率减慢。Ammer等［10］的研究发现，RA诱导分化6 d可导致Giα亚基明显上调，这与阿片受体表达上调似乎是一致的。

Diprenorphine是阿片受体拮抗剂，对三种亚型(μ，δ，κ)的阿片受体都有很高的亲和力，尤其是对κ和μ亚型。有研究表明［2］，SH-SY5Y细胞上表达有μ和 δ受体，比例大约为5∶1。也有研究［11］认为SH-SY5Y细胞上表达有较多的κ受体。因为我们的研究利用［3H］-diprenorphine作为放射性配体测定受体表达量，并不能明确是何种亚型阿片受体在诱导分化后发生变化。我们发现对照细胞的阿片受体膜表达量约为77×10－12mol·g－1膜蛋白，这与Lawrenc［12］的报道基本一致。Jenab 等［13］报道 RA诱导分化后，SH-SY5Y细胞μ受体mRNA表达增加了2倍;Zadina等［14］报道RA诱导分化后，SH-SY5Y细胞μ受体数量上调40%;我们的研究显示，诱导分化后细胞膜阿片受体表达提高了约1.6倍，与上述文献基本一致。阿片受体的表达量与下游信号强度相关，我们的研究为合理使用SH-SY5Y细胞作为阿片依赖细胞模型提供了数据支持。

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