表没食子儿茶素没食子酸酯抗甲型流感病毒的作用研究

李湘潋，刘叔文，杨 洁

(南方医科大学药学院，广东 广 州 510515)

流感作为严重威胁公众健康的病毒性传染病防治形势很不乐观。每年约有15%～20%的人群被流感病毒感染，在美国导致约3.6万人死亡，在世界范围内导致至少50万人死亡［1］。流感病毒属于RNA病毒的正粘病毒科，分为甲、乙、丙3个类型，其中甲型病毒最为常见也最容易发生变异。甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为15个亚型(H1～H15)，N有9个亚型(N1～N9)。甲型流感病毒H5N1亚型是甲型流感病毒的一个高致病性亚型。近年，世界各地相继出现H5N1亚型禽流感病毒感染人类的情况，感染死亡率高达60%，提示其具有造成大流行的潜能，因此高致病性禽流感和人禽流感的防治工作备受关注。目前，现有的治疗药物仅4种，且只作用于M2离子通道和神经氨酸酶两个靶点，远不能满足临床和社会的需求。积极研究防治流感病毒的新型药物，不仅是当前医学界面临的挑战，也是关乎社会经济发展的重要课题。

表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是绿茶中含量最高的成分，占绿茶儿茶素类总量的0.10－0.15，它是2-连苯酚基苯骈吡喃与没食子酸形成的酯，同时，因其结构中有6个邻位酚羟基而具有优于其他儿茶素类化合物的许多性质。目前国内外大量研究证实其具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌及抗心血管疾病等作用，是一种极具开发潜力的天然产物，其中抗病毒的活性备受关注［2－4］。为此，文中对EGCG的抗甲型流感活性和作用机制进行了研究，为甲型流感病毒感染的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与质粒 293T细胞和MDCK细胞，由本实验室保存。细胞培养液为10%胎牛血清，10 000 U·L－1青霉素、链霉素的DMEM高糖培养基。

A/Thailand/Kan353/2004-HA和 A/Thailand/Kan353/2004-NA质粒由Frank Kirchhoff教授(University of Ulm，Germany)惠赠。pNL4-3R-E-Luc来自美NIH的AIDS Research and Reference Reagent Program。pNL4-3R-E-Luc是在pNL4-3进行移码突变使其不表达Env蛋白和Vpr蛋白，并插入绿色荧光蛋白基因的一个重组质粒。

1.1.2 病毒株 甲型流感病毒FM_1株(A/FM/1/47，H1N1)由南方医科大学热卫系赵卫教授惠赠，经本实验室SPF鸡胚传代扩增，－80℃保存。

1.1.3 试剂 DMEM细胞培养基，新生胎牛血清，胰蛋白酶，青霉素及链霉素购自中国Invitrogen公司;荧光素酶检测试剂盒以及细胞裂解液购自Pro-mega公司;感受态细胞DH5α由香港Dgen公司制备;转染试剂PEI购自起福生物科技有限公司;神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒购自碧云天公司;其余生化试剂均为国产分析纯。

1.1.4 化合物与样品 EGCG(纯度 ＞98%)购于厦门勋健中药植物化学有限公司;阳性对照药物CL-385319由本实验室合成，含量99.7%;利巴韦林盐酸盐由广州肇庆星湖生物化学制药厂生产，含量99.5%。

1.2 实验方法

1.2.1 检测EGCG对 H5N1假病毒进入的抑制作用 以每孔1×104个MDCK细胞接种于96孔细胞培养板中，培养24 h;50 μl不同浓度的化合物与50 μl假病毒在37℃下孵育30 min，阳性对照药为CL-385319［5］。将孵育后的病毒与化合物的混合物共同加入到MDCK细胞中，48 h后，根据荧光素酶检测试剂盒说明书，检测化学发光值，判断药物抑制病毒进入的活性。

化合物抑制率/%=［1－(E－N)/(P－N)］×100%。

E代表实验组的化学发光值，N代表阴性对照组的化学发光值，P代表阳性对照组的化学发光值。化合物的半数抑制浓度(IC50)作为化合物的抗流感病毒活性的指标。

1.2.2 神经氨酸酶抑制实验 按照碧云天神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒说明书操作。在96孔荧光酶标板内每孔加入70 μl神经氨酸酶检测缓冲液，然后每孔加入10 μl神经氨酸酶，再每孔加入10 μl各个浓度的化合物，振动摇匀1 min后与37℃孵育2 min;加入10 μl的神经氨酸酶荧光底物，再振动1 min，37℃孵育20 min进行荧光测定。

1.2.3 两种给药方式检测EGCG对甲流FM_1株病毒的抑制活性 取处于指数生长期的MDCK细胞铺在96孔板上，细胞数为1×104个/孔，长成单层分别以2种不同方式进行抗流感病毒试验［6］:①EGCG对流感病毒侵入MDCK细胞的阻断作用(预防作用):在EGCG无毒浓度范围内，以不同浓度的药物预先与细胞孵育2 h，用PBS洗涤，每孔加入含有100 TCID50的病毒液感染细胞，当病毒对照孔细胞病变达到75%以上时，记录细胞病变结果，判断药物疗效。②药物对流感病毒的治疗作用:先以100 TCID50的病毒液感染细胞，37℃培养2 h后，用PBS洗涤，加入不同浓度的药物，同上法培养与检查。实验同时设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性药物病组，与实验组同时观察CPE。采用MTT法［7］测定EGCG对细胞的毒性。确定半数毒性浓度(TC50)。Reed-muench 法［8］计算流感病毒 FM1在MDCK细胞中的组织半数感染量(TCID50)、半数抑制浓度(IC50)。计算治疗指数(TI)，TI=TC50/IC50。

2 结果

2.1 EGCG对H5N1禽流感病毒的进入有抑制作用 我们利用高致病性禽流感H5N1假病毒体系评价EGCG对H5N1A/Thailand/Kan353/2004毒株的抑制活性。由于pNL4-3R-E-Luc带有荧光素酶报告基因，当假病毒成功感染MDCK细胞后，荧光素酶在细胞内表达。表征荧光素酶活性的化学发光值与假病毒的感染能力成正比。如Fig 1A所示，病毒原液2倍稀释时化学发光值达到了107，表明制备的H5N1假病毒具有很强的感染能力。通过检查细胞裂解液的化学发光值，可以判定化合物的抑制活性。研究表明，EGCG能抑制H5N1假病毒的活性，其IC50为 145.10 μmol·L－1。EGCG 对 VSVG 假病毒没有抑制作用。由于这两种假病毒的制备只是转入的包膜蛋白质粒不同，因此EGCG抗H5N1假病毒的靶点为血凝素蛋白蛋白或神经氨酸酶，见Fig 1B。

2.2 EGCG对神经氨酸酶的抑制活性 我们用试剂盒检测了EGCG对神经氨酸酶的活性的影响。EGCG对神经氨酸酶具有明显的抑制活性，IC50为417.20 μmol·L－1，见 Fig 2。

2.3 EGCG能明显抑制甲流FM_1活病毒 MTT法测 EGCG 的 TC50为 399.21 μmol·L－1，采用预防给药方式，EGCG对H1N1型甲流病毒FM_1株的IC50为 6.88 μmol·L－1，TI为 58.02。采用治疗给药方式，EGCG对H1N1型甲流病毒FM_1株的IC50为14.83 μmol·L－1，TI为 26.92。CPE 观察结果显示，无论治疗给药还是预防给药方式，EGCG均能不同程度地抑制流感病毒A/FM1/1/47(H1N1)增殖。相同的给药方式下，随着药物作用浓度的升高，抑制作用增强。

3 讨论

EGCG是绿茶中提取的一种活性成份，由于具有多种生物活性而备受关注，尤其对EGCG抗流感病毒的作用的研究日益加深［9－10］。我们的前期研究已证明EGCG和EGCG衍生物能够通过抑制gp41六螺旋束核心结构的形成而阻止HIV病毒的进入［11］。高致病性禽流感(H5N1)是一种人禽共患的正粘病毒科流感病毒属病毒引起的急性接触性传染病，病毒毒性很强，死亡率高。

本研究采用H5N1假病毒体系检测EGCG对病毒的抑制作用。H5N1假病毒检测体系适用于高通量筛选流感病毒的进入抑制剂，具有高效、稳定、安全的特点［7］。假病毒尚失了病毒的自我复制能力，只具有单轮感染性，生物安全性高，可以在生物安全2级实验室完成。

Fig 1 A:Infectivity of H5N1 pseudoviruses in MDCK cells.B:Inhibitory activity of EGCG against H5N1pseudoviruses.C:Inhibitory activity of CL-385319 against H5N1 pseudoviruses

研究表明，EGCG对源自A/Thailand/Kan353/2004的H5N1假病毒毒株有明显的抑制作用，但对VSVG假病毒没有抑制活性。由于两种假病毒仅是包膜蛋白不同，表明EGCG是特异性作用于H5N1流感病毒的包膜蛋白，即血凝素(hemagglutinin，HA)或神经氨酸酶。

Fig 2 Inhibitory activity of EGCG against H5N1 neuraminidase

流感病毒进入靶细胞是由病毒包膜上的血凝素介导的。该蛋白由HA1和HA2两个亚基组成，其中HA1亚基与靶细胞膜上的唾液酸受体结合，HA2则为跨膜亚基，介导病毒膜与胞内体膜的融合［12］。EGCG的血凝抑制实验为阴性(结果未提供)，表明EGCG的作用位点不是HA1亚基上的唾液酸受体结合区域，因此其抑制流感病毒进入的作用位点可能是HA2亚基。神经氨酸酶是流感病毒表面的重要蛋白。EGCG也能抑制神经氨酸酶的活性，表明EGCG对神经氨酸酶的抑制可能也是其抗流感病毒机制之一。

根据HA的同源性分型，H1和H5亚型流感属于同一组别。为此，我们检测EGCG体外抑制H1亚型流感病毒FM_1株的作用。EGCG对于2种不同的给药方式(治疗给药和预防给药)，体外对H1N1型甲流病毒FM_1株均具有抑制作用，但抑制作用存在着一定差异，预防模式优于治疗模式，其原因可能是预防模式时，吸附在细胞表面的EGCG能发挥病毒进入抑制的作用，而治疗模式在接种后给药，病毒已经进入靶细胞，导致EGCG的进入抑制作用不能发挥。

本研究结果提示了EGCG在体外具有明显的抗甲型流感病毒作用，可作用于H5N1禽流感病毒的进入阶段，同时能够在一定程度上抑制病毒的神经氨酸酶活性，说明EGCG是通过多靶点作用而发挥抗H5N1禽流感病毒的作用。EGCG体外抗甲型流感病毒作用的研究为EGCG的开发、利用以及进一步研究提供了重要依据。

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