高效液相色谱法测定葡萄酒中苯甲酸含量的不确定度评定

汤海青，顾晓俊，殷居易，欧昌荣

(1.宁波出入境检验检疫局技术中心，浙江宁波315012;2.宁波大学海洋学院，浙江宁波315211)

苯甲酸及其钠盐作为酸性防腐剂，在食品行业中广泛使用。根据我国相关食品安全国家标准，苯甲酸及其钠盐可被限量用于多类食品，包括蜜饯凉果、腌渍蔬菜、调味料、果蔬汁等，而葡萄酒等产品不在允许添加之列［1］。但由于葡萄酒在自然发酵生产过程中可能产生一定量的苯甲酸成分，所以GB 15037－2006《葡萄酒》中对苯甲酸或苯甲酸纳(以苯甲酸计)并未规定不得检出，而是给出了允许检出的最高限量值［2］。在葡萄酒中人工添加苯甲酸及其钠盐，可抑制酵母和霉菌的生长，对细菌的生长也有一定作用。因此，苯甲酸及其钠盐可能被非法使用于葡萄酒的防腐和保藏，如总糖较高、酒精度较低的一类保质期相对较短的葡萄酒产品，特别应注意苯甲酸在假冒伪劣葡萄酒中的滥用。为了对检测结果进行准确表达和有效评价，如实反映测量的置信度和准确度，本文采用GB/T 5009.29－2003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》中的第二法高效液相色谱法［3］，对一例苯甲酸含量在允许检出的最高限量值50mg/L附近的样品进行测定。并根据国家计量技术规范JJF 1059－1999《测量不确定度评定与表示》的要求［4－5］，使用实验室内部确认的数据计算不确定度。对葡萄酒中苯甲酸测量结果的不确定度进行分析，为评定测量结果提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苯甲酸标准品(1.00mg/mL) 中国计量科学研究院;甲醇(色谱纯) 美国天地公司;其余试剂 均为分析纯。

LC－30A高效液相色谱仪 日本岛津公司;梅特勒XS204电子天平、梅特勒T50M自动电位滴定仪 瑞士梅特勒公司;JULABO SW22恒温水浴 德国JULABO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 苯甲酸标准使用液的配制 将苯甲酸标准品于室温(20±4)℃平衡10min，摇动均匀，用移液管移取10mL至100mL容量瓶，得到浓度为100μg/mL的标准中间液。用移液器分别准确吸取0.2、0.5、1.0、2.0mL至10mL容量瓶中定容，混匀后为2、5、10、20μg/mL标准使用液。

1.2.2 样品前处理 准确移取10.0mL葡萄酒样品，放入烧杯中，水浴加热除去乙醇，氨水(浓氨水∶水=1∶1)调pH约7.0，用超纯水定容至25.0mL，经0.45μm滤膜过滤。作为待检测样品，同时做空白对照。

1.2.3 试样测定 按岛津高效液相色谱操作规程规定的程序开机平衡系统，待基线稳定后，取制备好的待测样品液进样分析，记录色谱图，用多点法峰面积校准定量。色谱条件:色谱柱为Hyersil BDS C18柱，流动相为 0.02mol/L乙酸铵溶液/甲醇(85/15，V/V)，柱流速 1mL/min，进样量10μL。

1.3 数学模型的建立

样品中苯甲酸含量计算公式如下:

式中，X为样品中苯甲酸含量(mg/L);C为样品苯甲酸浓度(μg/mL);V为样品最终定容体积(mL);Vm为样品体积(mL);F为稀释因子。

上述计算公式是由测量原理得出的，没有考虑各种随机因素对不确定度的影响，在此应引入反映随机影响的重复性系数frep，其数值等于1。评定不确定度的数学模型应写成如下形式:

1.4 测量不定度来源

根据检测过程和数学模型，不确定度的主要来源有:平行实验重复性产生的相对标准不确定度u(frep);移取样品体积产生的相对不确定度u(Vm);试样前处理定容体积引起的相对不确定度u(V);标准溶液浓度引起的相对不确定度u(C);液相色谱仪定量重复性产生的相对不确定度u(LC)。相对标准不确定度计算公式见式(3):

u(X)=［u(frep)2+u(Vm)2+u(V)2+u(C)2+u(LC)2］－1式(3)

2 结果与分析

2.1 测量重复性产生的标准不确定度

在重复条件下，对葡萄酒样品进行7次测量，测量数据见表1。

表1 平行测量结果Table 1 Results of parallel determination

单次测量的实验标准偏差为:

在日常分析中，测定两份样品报告平均值，故平均值的相对标准不确定度为:

该测量重复性标准偏差是本测量所有随机影响的合成，因此在随后各分量的评定中无需再考虑随机影响。

2.2 样品移取体积的相对标准不确定度u(Vm)

用10mL A级单标线移液管移取样品，按照计量检定规程JJG 196－2006［6］，最大容量允差为0.020mL。按均匀分布(矩形分布)考虑，由此引入的相对标准不确定度为实验室的温度在±4℃之间变动，考虑溶液温度与校正时温度差引起的体积不确定度。假设温度变化时矩形分布，用水的膨胀系数(2.1×10－4/℃)计算，产生的体积变化引起的相对不确定度为合成得到样品移取体积的相对标准不确定度:

2.3 定容体积的标准不确定度

本次实验样品定量总体积为25mL，采用25mL A级容量瓶定容，按照JJG 196－2006，最大容量允差为±0.03mL。按三角形分布考虑，由此引入的相对标准不确定度为实验室的温度在±4℃之间变动，考虑溶液温度与校正时温度差引起的体积不确定度。假设温度变化时矩形分布，产生的体积变化引起的相对不确定度为合成得到样品移取体积的相对标准不确定度:

2.4 苯甲酸标准溶液的相对标准不确定度

2.4.1 液体标准品引入的不确定度 根据苯甲酸标准物质证书，苯甲酸溶液标准物质的标准值为1.00mg/mL，相对扩展不确定度为1%，包含因子k=2，因此其相对标准不确定度u(C1)=0.005。

2.4.2 由苯甲酸标准储备液稀释配制标准工作液产生的标准不确定度u(C2) 将10mL标准品溶液一次性全部转移至100mL A级容量瓶，稀释至浓度100μg/mL。再用微量可调移液器移取标准稀释液 200、500μL、1.0、2.0mL 至 10mL A 级容量瓶中并定容，配制成 2、5、10、20μg/mL 的苯甲酸标准系列工作液。产生的不确定度

按照JJG 196－2006，100mL A级容量瓶的最大容量允差为±0.10mL。按三角形分布考虑，由此引入的相对标准不确定度为;考虑溶液温度与校正时温度差引起的体积不确定度0.00048。合成得到样品移取体积的相对标准不确定度:

微量可调移液器允差±0.6%，按矩形分布，由此引入的相对标准不确定度为:

10mL A级容量瓶的最大容量允差为±0.02mL。按三角形分布考虑，由此引入的相对标准不确定度为。考虑溶液温度与校正时温度差引起的体积不确定度0.00048。合成得到样品移取体积的相对标准不确定度:

上述不确定度互不相关，合成得:

2.4.3 校准曲线拟合引入的标准不确定度u(C3)制备4个苯甲酸标准溶液ci，每个浓度测定3次，得到4×3共12个峰面积—浓度值(cij，Aij)，测定结果见表2。

表2 标准溶液校准曲线Table 2 Calibration curve of standard solution

用最小二乘法拟合，截距a=3.0294×10－5，斜率b=0.02893，得标准曲线 Aij=3.3 ×104cij－954.78。

实际测定中，对待测样液测定2次(p=2)，响应值分别为133792和134843，代入公式，求得预估浓度值 c=4.04μg/mL。

由标准工作曲线求c时产生的s(y)标准不确定度为0.013。则标准曲线引入的相对不确定度 s(Cp)为:

2.4.4 苯甲酸标准溶液的相对标准不确定度 将上述各不确定度分量合成得到苯甲酸标准溶液的相对标准不确定度为:

2.5 由高效液相色谱仪产生的相对标准不确定度

由校准证书上可知，岛津高效液相色谱仪的定量重复性误差为1.0%，按均匀分布计算，则液相色谱仪的相对标准不确定度为

2.6 不确定度的合成

上述各项不确定度分量(见表3)互相独立，葡萄酒样品中苯甲酸的相对合成标准不确定度为:

u(X)=X［u(frep)2+u(Vm)2+u(V)2+u(C)2+u(LC)2］－1=0.49μg/mL

表3 不确定度分量Table 3 List of uncertainty components

2.7 扩展不确定度及结果

取包含因子k=2，置信水平约为95%，以全进法修约，计算扩展不确定度U(X)=0.49×2=0.98≈1mg/L。按 GB/T 5009.29－2003《食品中苯甲酸、山梨酸的测定》中的第二法规定的条件测定葡萄酒样品中的苯甲酸(计算结果保留两位有效数字)，测得平均值及其不确定度为(51±1)mg/L，包含因子k=2，置信水平约为95%。

3 结论

通过对测定苯甲酸过程中产生的不确定度进行量化，说明本实验中高效液相色谱法测定葡萄酒样品的苯甲酸含量过程中，由标准溶液和液相色谱仪引入的不确定度为主要来源，其次为测量重复性和移取样品体积引入的不确定度。根据CNAS－GL27声明检测和校准结果及与规范符合性指南［7］，当测试结果高于上限或低于下限，而延伸扩展不确定度与上限或下限迭交时，则在95%的置信水平上不能声明符合或是不符合标准。在置信水平低于95%的情况下，可能做出不符合规范的声明。本实验中结果值51mg/L高于规定上限值50mg/L，向下延伸不确定度后的结果值与上限值迭交，因此在95%的置信水平上不能声明符合或是不符合标准。

［1］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB 2760－2011，食品安全国家标准 食品添加剂使用标准［S］.北京:中国标准出版社，2011.

［2］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB 15037－2006葡萄酒［S］.北京:中国标准出版社，2007.

［3］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.29－2003，食品中山梨酸、苯甲酸的测定［S］.北京:中国标准出版社，2004.

［4］国家质量技术监督局，JJF 1059－1999测量不确定度评定与表示［S］.北京:中国计量出版社，1999.

［5］中国合格评定国家认可委员会，CNAS－GL 06化学分析中不确定度的评估指南［S］.北京:中国计量出版社，2006.

［6］国家质量监督检验检疫总局，JJG 196－2006常用玻璃量器检定规程［S］.北京:中国计量出版社，2006.

［7］中国合格评定国家认可委员会，CNAS－GL27声明检测和 校准结果及与规范符合性指南［S］.北京:中国计量出版 社，2009.