β－聚苹果酸/明胶微胶囊的制备

吴艳丽，马 霞，俞鸿千

(上海应用技术学院香料香精技术与工程学院，上海201418)

聚苹果酸(poly malic acid，PMLA)是一种水溶性脂肪族聚酯，以L－苹果酸(MLA)为唯一单体通过酯键联接而成，它是天然多聚物中新近开发的一种生物多聚物。与许多其他天然多聚物不同，PMLA分子中有许多自由羧基，这些自由羧基赋予了它许多特别的性质。PMLA最初是在1969年由微生物学家Shimada［1］等在研究一种环状青霉索(Penicillium cyclopium)时发现的，1979年Vert等首次用化学法将其合成出来［2］。PMLA以苹果酸为基本结构单元，以一个分子苹果酸的－OH和另一个分子苹果酸α－或β－COOH连接而成。有三种结构的PMLA:α－型、β －型和，α，β －型，其结构如图1 所示［3］。可用通式PMLAxHyRz(x:L－苹果酸单元所占比例，y:侧基－COOH所占比例，R:侧基取代基，z:侧基取代基所占比例)表示［4］。

图1 聚苹果酸的结构式Fig.1 The molecular structures of poly malic acid

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

聚苹果酸(PMLA) 实验室自制;明胶 Sigma;aOH、冰醋酸等 国药集团化学试剂有限公司。

电子天平 YP1002N，上海精科;定式恒温磁力搅拌器 Feb－94，上海闵行虹谱仪器厂;离心机 L－530，长沙湘仪离心机仪器有限公司;旋转蒸发器RE－52A，上海亚荣生化仪器厂;冷冻干燥器 FD－1－50，北京博医康实验仪器有限公司;纳米粒度仪 Zetasizer Nano ZS型，英国马尔文仪器有限公司;实验室pH计FE20，梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;冷冻恒温振荡器 DHZ－D，太仓市实验设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵制备聚苹果酸［5－7］将发酵液于4200r/min离心30min，取清液。调pH至5，加等体积乙醇，于3500r/min离心10min，取清液。将清液浓缩至1/2体积，加2倍体积乙醇，于3500r/min离心10min，取清液。将清液浓缩至1/3体积，再加4倍体积乙醇，于4200r/min离心10min，取沉淀。用少量蒸馏水将沉淀溶解，透析2d，每4h换一次水。将透析好的溶液冷冻干燥24h，即得到产物PMLA。

1.2.2 预实验 本课题是首次以PMLA和明胶为壁材制作微胶囊，根据复凝聚法的原理可知［8－10］，壁材分散相中含有两种以上的亲水胶体，通过调节介质pH等，使带异性电荷的两种胶体之间因电荷中和而溶解度降低，引起相分离而产生凝聚。PMLA为阴性，明胶的等电点为4.8～9.0，pH低于4.8时表现为阳性，反之大于9.0时表现为阴性。故PMLA和明胶可以聚合成为微胶囊壁材。

为了得到体系均匀、PdI较小、粒径较小的微胶囊，首先要确定两种壁材的滴加顺序和滴加时所用的器材。根据实验室条件，选用输液管，酸式滴定管和酸式滴定管头加装输液针头三种滴加器材，PMLA滴入明胶和明胶滴入PMLA两种滴加顺序。

1.2.3 Plackett－Burman实验 应用 Design Expert软件对实验进行 Plackett－Burman 设计(表 1)［11］。对实验过程的6个主要因素进行筛选:即择PMLA浓度，明胶浓度、明胶pH、滴速、转速和搅拌反应时间，外加5个虚拟变量，每个变量分别确定(+)和(－)两个水平，以微胶囊粒径和PdI为考察量［12］。

表1 Plackett－Burman设计因素水平Table 1 The levels of various factors in Plackett－Burman design

1.2.4 Box－Benhnken实验 在PB实验的基础上，选取较佳的因素和水平，采用响应面分析方法对微胶囊制作条件进行优化，获取最佳工艺参数，根据Box－Benhnken 中心组合实验设计原理［12］，选取对微胶囊PdI影响显著的因素——明胶浓度，以及三个便于控制的因素PMLA浓度，明胶pH和反应时间，运用Design Expert软件进行四因素三水平响应面设计，设计水平见表2，响应面实验结果见表5。

表2 Box－Benhnken设计因素水平Table 2 The levels of various factors in Box－Behnken Design

2 结果与讨论

2.1 预实验结果

用酸式滴定管加装针头制微胶囊，微胶囊的粒径在200～400nm之间，但是体系PdI在0.5～1.0之间，偏大;用酸式滴定管制微胶囊，其粒径在500～1200nm之间，偏大，但体系PdI很小;用输液管制微胶囊，微胶囊粒径很大，且滴速很难控制。通过对比，选择酸式滴定管加装针头来制作微胶囊。

2.2 Plackett－Burman 实验结果

根据PB实验结果进行分析，如表3和表4。

表3 对粒径分析的偏回归系数及因素显著性分析Table 3 The particle diameter of the two model test of significance for the regression coefficients

表4 对PdI分析的偏回归系数及因素显著性分析Table 4 The PdI of the two model test of significance for the regression coefficients

表3可以明显看出因素X3(滴速)、X6(转速)、X8(虚拟因素)和X10(虚拟因素)为主要影响因子，其影响值分别为20.63、22.90、23.62和22.37，而另外3个虚拟因素X7、X9和X11对粒径的低值影响(2.84、1.65、1.72)也表明了该模型有一定的适用性。经影响因素筛选，得到以粒径为响应值的线性方程为:

Y1=359.78－38.60X3+40.67X6－41.30X8+40.20X10

方差分析模型的Prob(P)＞F值为0.0015，表明所得回归方程达到极显著，即该模型在被研究的整个回归区域拟合很好;负相关系数R2=0.8952，说明相关性较好;校正决定系数Adj R2=0.8352，表明83.52%的实验数据的变异性可用此回归模型来解释;通常情况下变化系数(CV)越低，实验的可信性和精密度越高，CV值等于10.01，表示PB实验的可信度和精确度较好;精密度(Adeq Precision)是有效信号与噪声的比值，大于4.0视为合理。本实验精密度达到10.506。

同上分析得到:Y2=0.61－0.13X2+0.066X4+0.063X6

2.3 Box－Benhnken 实验结果分析［13－14］

用Design Expert软件得到的分析结果，微胶囊粒径的回归方程为:

Y3=+299.48+39.20A－11.16B－93.77C+22.69D+51.85AB+6.90AC－122.20AD－65.17BC+176.10BD+125.92CD+154.13A2+45.16B2+130.98C2+53.34D2

表5 Box－Benhnken实验设计结果Table 5 The results of Box－Behnken design

由表7可知，该模型F值为14.76(p＜0.0001)说明模型显著，仅有0.01%的可能产生噪音。在失拟项p=0.0592＞0.05不显著，推断这个模型不容易产生误差。，R2=0.9365。这个模型中 C、BD、A2、C2是显著影响因素。各因素对微胶囊粒径的影响程度从大到小依次为明胶pH、PMLA浓度、反应时间和明胶浓度。明胶pH的影响程度尤为显著(p＜0.0001)，其次是 PMLA浓度(p＜0.05)，反应时间和明胶浓度对微胶囊粒径的影响不显著(p＞0.05)。

等高线的形状可以反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素的交互作用显著，而圆形则与之相反［15］。如图2至图6所示为因素之间的交互作用和对粒径的影响。

表6 粒径的二次模型方差分析Table 6 Particle size of two model analysis of variance

表7 粒径的二次模型回归方程系数显著性检验Table 7 The particle diameter of the two model test of significance for the regression coefficients

图2 Y=f(A，B)响应面立体分析Fig.2 Y=f(A，B)response surface analysis

图3 Y=f(A，C)响应面立体分析Fig.3 Y=f(A，C)response surface analysis

图4 Y=f(A，D)响应面立体分析Fig.4 Y=f(A，D)response surface analysis

图5 Y=f(B，C)响应面立体分析Fig.5 Y=f(B，C)response surface analysis

图6 Y=f(C，D)响应面立体分析Fig.6 Y=f(C，D)response surface analysis

图7 Y=f(B，D)响应面立体分析Fig.7 Y=f(B，D)response surface analysis

通过Design Expert软件对响应面实验数据的计算，得到最优条件组合为:PMLA浓度0.09%，明胶浓度0.13%，明胶 pH4.0，反应时间24.36min。在此条件下，可以得到粒径为204.57nm微胶囊。

为了方便实验，取PMLA浓度0.10%，明胶浓度0.13%，明胶pH4.0，反应时间25min时验证回归模型的有效性，根据得到的最优条件，做三组平行实验。结果表明，实际测量值288.37nm与预测值接近，说明该模型是合理有效的且具有一定的实际指导意义。

3 结论

利用统计学的方法建立了制作PMLA－明胶微胶囊的二次多项数学模型。通过对模型响应面图及等高线图进行分析，获得影响微胶囊粒径和体系PdI的最佳条件，并利用模型方程对其进行预测。结果表明:PMLA浓度、明胶pH对微胶囊粒径有显著影响，反应时间对体系PdI有显著影响;PMLA浓度与明胶pH对粒径的交互影响不显著;PMLA浓度与明胶浓度、明胶浓度与明胶pH对PdI的交互影响显著。由粒径和PdI的二次多项式回归方程可知:PMLA浓度0.1%，明胶浓度0.13%，明胶pH4.0，反应时间25min时，微胶囊粒径为288.37nm。而验证实验证明了实际测量值与预测值之间具有较好的拟合度，说明该模型是合理有效的，具有一定的实际指导意义。

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