响应面法优化光合细菌PSB－B的生长条件

胡青平，张 红，周 冰，张亚军，李贵琴，田呈瑞

(1.陕西师范大学食品工程学院，陕西西安710062;2.山西师范大学生命科学学院，山西临汾041004)

光合细菌(Photosynthetic bacteria，简称PSB)是自然界中能以光合作用产能的细菌，是地球上最早出现的具有原始光能合成体的原核生物［1］。它具有固氮、固碳、脱氢、硫化物氧化等不同的生理生化功能，并在自然界的氮、碳、硫循环中发挥着重要作用。因此，具有重要的科学研究价值［2－3］。光合细菌分布广泛［4－6］，可直接处理高浓度有机废水，不存在污泥处理问题;可综合利用作饵料和肥料，所需场地少费用低。还在减防鱼病、培养有益藻类和丰富饲料添加剂等方面具有巨大的应用价值［7］。所以已在许多科学领域内引起了人们的高度重视。目前，对光合细菌生长条件优化的研究有很多［8－10］，主要有温度、pH、光照、培养基成分等，但温度、pH、培养基盐含量对光合细菌的影响及其相互作用的研究却很少见，这些条件与光合细菌的生长繁殖也起着至关重要的作用，具有很重要的现实意义。本研究从山西临汾汾河大桥下的表层污泥中分离得到光合细菌PSB－B，该光合细菌对柠檬酸类废水有较好的降解作用(数据未给出)且前期实验还发现，盐浓度对PSB－B菌的生长影响很大，因此，优化PSB－B菌的生长条件为其进一步的开发应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

光合细菌PSB－B 分离于山西临汾汾河大桥下的表层污泥，纯化后分别保存于固体和液体培养基中，液体菌菌液颜色为深红色并有红色沉淀，菌种活力良好;酵母膏蛋白胨液体培养基［7，9－10］:酵母膏 3g，蛋白 胨 3g，CaCl23g，MgSO4·7H2O 3g，蒸 馏 水1000mL，pH6.8;酵母膏蛋白胨固体培养基添加琼脂20g，在盐浓度的实验中，添加一定浓度的NaCl。

BSG－300光照培养箱、YXQ－LS－SII全自动立式电压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;722S可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生长条件研究

1.2.1.1 单因素实验 在250mL的液体培养基中接种光合细菌PSB－B的菌液10mL，分别在pH为7、盐浓度为0单位的条件下，设置温度为22、24、26、28、30、32℃来分析其最适温度;在温度为28℃、盐浓度为0单位的条件下，设置 pH 为 5、6、7、8、9 来分析其最适pH;在pH为7，温度为28℃的条件下，设置培养基盐浓度为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6g/100mL 来分析其最适盐浓度。

1.2.1.2 响应曲面实验设计［11－14］根据单因素实验结果，选择温度、pH和盐浓度3个因素作为响应变量，利用Design－Expert软件按照旋转中心组合设计原理，以PSB－B菌在600nm下的吸光度为响应值(OD)，通过响应面曲面分析进行生长条件的优化，得到最优生长条件。各实验组的编码与取值见表1。共20个实验点，其中14个为析因点，6个为零点。零点实验进行6次，做误差估计。

表1 响应面分析因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.2 光合细菌生长量测定 以上实验均接种于300mL的锥形瓶中，用封口膜封口，置于光照强度为3679.7～4987.0Lux的光照培养箱中培养5d，每天定时摇晃一次，用可见光分光光度计在600nm处测量光密度值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

分别研究了温度、pH和盐浓度三个因素对PSB－B菌生长的影响，结果见图1～图3。

从图1中可知，PSB－B菌在接种后生长迅速，随时间延长，光密度值增加，但温度为28℃时，光密度值增加最快，生长态势最好，第5d达到最高光密度1.319，温度过低或过高都会对PSB－B菌生长产生不利影响，温度过低菌体生长缓慢，温度过高菌体生长受到抑制。因此，最适温度为28℃。从图2中可知，PSB－B菌在pH7时光密度值最高，第5d达到最高光密度1.287。pH6和pH8时光密度值略低于pH7时的光密度值。但pH5、pH9时光密度值明显低于pH7时的光密度值，因此，pH过低或过高都会严重影响PSB－B菌生长状况。所以最适pH7。从图3中可知，培养基盐浓度为0.1～0.3g/100mL时光密度值增加，盐浓度超过0.3g/100mL后PSB－B菌的生长受到抑制，光密度值迅速降低。因此，最适盐浓度为0.3g/100mL。由此可知，三因素对PSB－B菌的生长都有一定的影响，最佳的单因素实验结果分别为:温度28℃，pH7，盐浓度0.3g/100mL。

图1 不同温度下PSB－B菌的生长情况Fig.1 The growth of bacteria PSB－B at different temperatures

图2 不同pH下PSB－B菌的生长情况Fig.2 The growth of bacteria PSB－B at different pH

图3 不同盐浓度下PSB－B菌的生长情况Fig.3 The growth of bacteria PSB－B at different NaCl concentrations

2.2 响应曲面分析

2.2.1 响应面设计实验结果分析 运用Design－Expert数据统计分析软件，得到实验方案与结果，如表2。通过对表2数据进行回归分析，得回归模型:

OD=－44.93+2.305A+3.985B+4.470C－0.02163AB－0.1994AC+0.3925BC－0.03774A2－0.2559B2－3.163C2。对该模型进行回归分析，方差分析结果见表3。

表2 旋转中心组合实验设计方案和结果Table 2 Design and results ofcentral composite rotatable experiment

表3可知，该模型的p＜0.0001，表明该模型在95%水平上显著。其失拟值为0.8836＞0.05，不显著，模型较准确。说明该模型拟合程度良好，实验误差小，可以用此模型来分析和预测结果。模型中一次项A、B显著，二次项 A2、B2高度显著，C2显著，而交互项AC显著。表明对于光合细菌生长量，温度和pH表现出显著的线性影响，温度和NaCl则表现出显著的耦合影响。

表3 响应面回归模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.2.2 响应曲面分析与优化 根据回归方程，采用Design Expert软件对该模型绘制响应曲面图，考察所拟合的响应曲面的形状，图4～图6所示为回归方程预测的三个因素耦合影响下的响应面三维图及相应等高线图。

图4表明，温度和pH对PSB－B菌生长影响呈抛物线型关系，且均有一个极大值点。在当前实验范围内，当温度不变，随着pH的升高，OD值先升高后降低，当pH不变，随着温度的升高，OD值先升高后降低。OD值变化速率显示，温度的主效应略强于pH效应，等高线接近圆形，说明温度和pH的交互作用不显著。

图4 温度和pH对PSB－B菌生长影响Fig.4 Response surface for the effect of temperature and pH on the growth of bacteria PSB－B

图5表明，温度和盐浓度对PSB－B菌生长影响呈抛物线型关系，且均有一个极大值点。在当前实验范围内，当温度不变，随着盐浓度的升高，OD值降低，当盐浓度不变，随着温度的升高，OD值先升高后降低。OD值变化速率显示，温度对PSB－B菌生长影响大于盐浓度的影响，等高线呈椭圆型，说明两个因素之间交互作用显著，与方差分析结果一致。

图5 温度和NaCl对PSB－B菌生长影响Fig.5 Response surface for the effect of temperature and NaCl on the growth of bacteria PSB－B

图6表明，pH和盐浓度对PSB－B菌生长影响呈抛物线型关系，且均有一个极大值点。在当前实验范围内，当盐浓度或pH为高水平时，OD值随pH或盐浓度升高先升高后降低;当盐浓度或pH为低水平时，OD值随pH或盐浓度升高不断降低。OD值变化速率显示，pH和盐浓度对PSB－B菌生长影响相差不多，等高线接近圆形，说明pH和盐浓度的交互作用不显著。

图6 pH和NaCl对PSB－B菌生长影响Fig.6 Response surface for the effect of pH and NaCl on the growth of bacteria PSB－B

三组图直观地反映了各个因素对响应值的影响，利用Design－Expert软件进行实验结果优化，本实验主要目的在于优化PSB－B菌最适生长条件，通过分析得到优化结果为:当温度27.94℃，pH6.80，NaCl 0.25g/100mL时，光合细菌吸光度最大，为1.364。

2.2.3 实验结果验证 为检测响应曲面法所得结果的可靠性，再次进行实验，采用上述优化条件进行3次平行实验 实际测得的平均实验OD值为1.446。实验值与理论值相对误差为≤8%，证明应用响应曲面优化PSB－B菌生长条件是可行的。

3 结论

本文报道的PSB－B菌株对培养条件的要求及适应范围，即通过单因素实验研究影响PSB－B菌生长条件的主要因素，即温度、pH和盐浓度。利用Design－Expert设计软件，采用旋转中心组合实验设计法建立优化PSB－B菌最适生长条件的数学模型，根据回归分析可知PSB－B菌最适生长条件是:温度28℃、pH6.80、NaCl 0.25g/100mL。为进一步研究提供了科学依据。

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