酶法制备白鲢鱼蛋白粉的研究

王 丽，姜启兴，许艳顺，夏文水

(江南大学食品学院，江苏无锡214122)

淡水鱼的加工可开发鱼糜制品、鱼肠、鱼圆和鱼干以及鱼罐头等产品，这些产品已有工业化生产并在市场销售。另一类主要产品是鱼蛋白粉。鱼蛋白粉是用鱼肉通过消化、过滤、浓缩、喷雾干燥而得到的一种浅黄色至类白色的粉末，具有含水量低、利于贮藏的特点，可进行大规模工业化生产。目前，鱼蛋白粉的生产主要还是集中在饲用鱼粉方面，产品质量不高。已有学者在开发食用鱼蛋白粉，采用的技术主要是酶解技术［1－2］。Ting［1］等以龙头鱼为原料，通过酶解、冷冻干燥等工艺，开发出一种鱼蛋白粉产品。Ting［2］等制备了冻干带鱼蛋白粉并对其营养进行评价，表明带鱼蛋白粉蛋白质含量丰富，必需氨基酸含量高，具有很高的营养价值，可以作为蛋白质强化剂应用于食品工业中。但鱼蛋白粉产品还存在溶解性不好、分散性差等问题，需要进一步研究溶解性好、分散性好的鱼蛋白粉，以扩大鱼蛋白粉的应用范围。鱼蛋白溶液的干制通常有真空干燥法，但生产效率不高。喷雾干燥法是一种自动化程度高可连续大规模生产的干燥方法，生产的蛋白粉受热时间短、复水性好，质量高。鱼蛋白溶液浓度的高低和喷雾干燥条件对于干燥节能和蛋白粉质量有密切的关系。本文旨在通过研究木瓜蛋白酶水解条件对鱼蛋白水解度的影响以及喷雾干燥条件对蛋白粉物性和水溶性的影响，确定木瓜蛋白酶水解白鲢鱼蛋白的最适条件以及喷雾干燥的合理条件，最后对制得的鱼蛋白粉的营养品质进行分析，为食用鱼蛋白粉的开发应用提供指导与参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜活白鲢鱼(2～3kg) 购于无锡市滨湖区雪浪镇农贸市场;木瓜蛋白酶(酶活80万U/g) 广西南宁庞博生物科技有限公司;氢氧化钠、盐酸等其他试剂:分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

DK－8AXX型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;AB104－N型电子天平 上海第二天平仪器厂;EL3002型电子天平、pH计 梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;XBLL－25型多功能食品加工机 上海帅佳电子科技有限公司;TDL－5－A型离心机 上海安亭镇飞鸽牌离心机;XMTFCH－6000型消化炉 上海仪器检测有限公司;Qz－4型喷雾干燥设备 锡山林州干燥厂;Waters 600型高效液相色谱仪 美国waters公司;Agilent 1100型高效液相色谱仪 美国Agilent Techologies。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼处理 将购得的鲜活白鲢鱼，经宰杀、去鳞、去内脏、去头、去尾、剥皮，清洗干净后采肉，经初步破碎再用绞肉机绞碎成均匀糜状。

1.2.2 鱼肉酶水解 称取500g鱼糜置于酶解罐中，加入一定量的蒸馏水，设定温度，调整pH，加入一定量的木瓜蛋白酶，水解一定时间;100℃灭酶15min，冷却至室温。

1.2.3 水解条件的确定 酶解过程中的酶解温度、pH、加酶量、酶解时间和底物浓度都会影响酶解的效率，主要以水解度为指标对酶解条件进行优化。

1.2.4 水解度测定 水解度(Degree of Hydrolysis，DH)测定参照 Aider－Nissen 等［3］，在中性及酸性条件下采用pH－stat法。水解度的计算公式:

式中:Vb:消耗的氢氧化钠溶液的体积，mL;Nb:氢氧化钠溶液的摩尔浓度，mol/L;α:氨基解离度(根据具体情况而定);Mp:底物中蛋白质的质量，g;Htot:底物蛋白质中的肽键总数，mmol/g，对于鱼肉，Htot=8.4mmol/g。

1.2.5 黏度的测定 使用Brookfield DV－Ⅱ+Pro型黏度仪在25、60℃恒温水浴条件下测定酶解液的体系黏度，使用SC4－18转子测量。

1.2.6 蛋白粉溶解度的测定 溶解度测定法［4］。

1.2.7 干燥条件的确定 根据尽可能降低能耗的原则，在不同的蛋白质水解液固形物含量与干燥进风温度和进料速度下得到鱼蛋白粉，测定该鱼蛋白粉的水分含量、白度、堆积密度、分散性和流动性等理化指标，从而确定鱼蛋白粉喷雾干燥的合适条件。

1.2.8 基本成分测定 水分含量:105℃恒重法［5］;粗蛋白质含量:凯氏定氮法［6］。

1.2.9 堆积密度的测定 将鱼蛋白粉从漏斗中撒落至10mL量筒中，测定10mL鱼蛋白粉的质量，换算出其堆积密度(g/mL)。

1.2.10 白度的测定 采用UltraScan Pro高精度分光测色仪测定粉末样品的L*、a*、b*值。按照下式计算产品的白度W:

W=100－［(100－L*)2+a*2+b*2］0.5

式中:L*值表示样品的亮度，值越大表示样品亮度越高;a*值表示样品的红绿值，+a*表示样品偏红，－a*表示样品偏绿;b*值表示样品的蓝黄值，+b*表示样品偏黄，－b*表示样品偏蓝。

1.2.11 润湿性的测定 在250mL烧杯中加入200mL去离子水，称取0.5g样品均匀撒布于水面上，在静置条件下，测定鱼蛋白粉从加入到润湿所需要的时间(s)。

1.2.12 分散性的测定 在100mL烧杯中加入50mL去离子水，加入5g鱼蛋白粉，在恒温磁力搅拌器上以一定的转速搅拌，记录从搅拌开始至粉全部分散所需的时间(s)，分散时间越少，分散性越好。

1.2.13 流动性的测定 将漏斗固定于水平放置的坐标纸上高度H处，将鱼蛋白粉沿漏斗壁倒入下方坐标纸上形成的粉圆锥体尖端接触到漏斗口为止，测定坐标纸上圆锥体底部的半径(R)，计算休止角α=arctg(H/R)，式中:H:漏斗口与坐标纸的垂直距离(mm);R:粉圆锥体底部的半径(mm);α:休止角，粉圆锥体沿底面直径纵切后所得三角形的底角(°)。休止角越小表明流动性越好。

1.2.14 均质鱼蛋白粉的制备 称取500g鱼糜，加入1000mL的蒸馏水，均质3遍后进行喷雾干燥，喷雾干燥条件同酶法制备鱼蛋白粉。

1.2.15 氨基酸组成分析 参照胡方园等［7］，采用OPA－FMOC柱前衍生化法对酶解产物氨基酸组成进行分析。

1.2.16 蛋白分子量分布的测定 参照胡方园等［7］，采用HPSEC凝胶过滤色谱法对酶解产物的分子量分布进行分析。

2 结果与讨论

2.1 酶解条件的优化

2.1.1 加酶量对蛋白水解度的影响在木瓜蛋白酶的不同添加量下，对鱼肉水解的影响见图1。从图中可以看出，蛋白水解度随着酶添加量的增大呈现出先增大后稳定的趋势。当加酶量为4000U/g蛋白质时，水解度已达到23.29%，酶浓度达到饱和;即使加酶量加大到7000U/g蛋白质，水解度为23.80%，没有明显增加。这可能是因为，反应刚开始时酶促反应体系处于底物过量的状态，所以水解度会随着酶添加量的增大而增大;而随着酶浓度的不断增加，直到饱和，此时酶与底物已经完全结合，再增加酶也不能与底物结合，故酶浓度的增大对反应速度几乎没有影响，所以选定酶添加量为4000U/g蛋白质。

图1 木瓜蛋白酶在不同加酶量时的水解度Fig.1 The degree of hydrolysis with Papain at different enzyme dosages

2.1.2 酶解温度对蛋白水解度的影响 酶的最适温度会随着体系的改变而有所差异，对不同温度下木瓜蛋白酶对鱼肉蛋白水解度的影响所得到的结果如图2所示。从图中可以看出，当温度低于50℃时，蛋白水解度随着温度的升高而增大，温度大于50℃以后，随着温度的上升，水解度呈下降趋势。这可能是由于温度低于50℃时，温度对酶促反应的影响更大，蛋白水解度随着温度的升高而增大;但当温度超过50℃后，酶受热变性的因素占优势，最终使酶促反应速度下降。在50℃时，蛋白的水解度达到最大值，所以选定50℃为木瓜蛋白酶酶解白鲢鱼蛋白的最适温度。

图2 木瓜蛋白酶在不同温度时的水解度Fig.2 The degree of hydrolysis with different temperatures

2.1.3 pH对蛋白水解度的影响在不同pH下木瓜蛋白酶对鱼肉蛋白水解度的影响结果见如图3所示。从图中可以看出，pH＜6.5时，水解度与pH呈正相关;当pH＞6.5时，水解度逐渐下降;因此，确定木瓜蛋白酶水解鱼肉的最适pH为6.5。

图3 木瓜蛋白酶在不同pH时的水解度Fig.3 The degree of hydrolysis with different pH

2.1.4 酶解时间对产物分子量分布的影响 在不同酶解时间(1、2、3、4、5、6、7h)下，水解产物经过喷雾干燥后的蛋白粉测定其分子量分布结果如图4所示。从图中可以看出，酶解1h得到的产物分子量＞1000的组分含量为14.22%，酶解2h的为13.72%，酶解3h的为11.21%，当酶解4h时，分子量＞1000的组分含量降低到9.10%，不同酶解时间得到的粉分子量差异显著。但是当酶解4h时，分子量＜180的组分含量也从1h时的9.91%增大到了11.43%，再延长酶解时间，分子量＜1000的组分含量变化非常缓慢，因此，酶解时间定为4h。

图4 不同酶解时间酶解产物分子量分布Fig.4 Molecular weight distribution of protein hydrolyzed by Papain with different time

2.1.5 底物浓度对蛋白水解度的影响 不同底物浓度对木瓜蛋白酶水解鱼肉的效果影响结果如图5所示。从图中可以看出，随着底物浓度的增大，木瓜蛋白酶对鲢鱼蛋白的水解度有一定的增大，但是当底物浓度高于5.5%以后，水解度出现明显下降。这可能是因为在一定的酶浓度下，当底物浓度较低时，反应速度与底物浓度的关系呈正相关;然而随着底物浓度的不断增加，酶的结合位点达到饱和，底物浓度再增加对反应速度已经几乎没有影响，但是底物浓度的增大同时会增加酶与蛋白特殊位点结合的空间位阻，从而导致酶促反应速度反而下降。可以得出，当底物浓度为5.5%时，木瓜蛋白酶对鲢鱼蛋白的酶解效果最好。

图5 木瓜蛋白酶在不同底物浓度时的水解度Fig.5 The degree of hydrolysis with different substance concentrations

2.2 喷雾干燥条件的优化

2.2.1 白鲢酶解液固形物含量对黏度的影响 对不同固形物含量下酶解液的黏度变化曲线见图6。从图中可以看出，酶解液的黏度随着固形物含量的增加而增加。在酶解液固形物含量较低时，酶解液的黏度变化缓慢，当酶解液固形物含量达到25%后，酶解液黏度急剧增大。当固形物含量达到30%以后，酶解液的黏度达到3000mPa·s以上，高黏度通常在生产中会导致液体难以雾化。因此，将料液浓缩到25%～30%后进行喷雾干燥比较为宜。

图6 白鲢鱼酶解液黏度随固形物含量的变化Fig.6 Changes of viscosity with the solids content

2.2.2 进料浓度的确定 将酶解液浓缩后喷雾干燥，不同浓度的酶解产物喷雾干燥后的蛋白粉品质见表1。从表中可以看出，随着进料浓度的增加，产品水分含量逐渐下降，白度逐渐下降，堆积密度逐渐增大，流动性变好，分散性也越来越好。当进料浓度＞20%时，鱼蛋白粉水分含量＜5%，而且鱼蛋白粉的流动性得到改善，堆积密度增加。流动性的提高可能是因为高浓度物料有利于形成大粒径的干燥颗粒［8－9］。堆积密度增大可能是由于进料浓度增大导致颗粒粒径增大以及粒子间距离减小所产生的综合效应。产品白度稍有下降，可能由外部过度干燥而引起［10］。

表1 进料浓度对鱼蛋白粉各项指标的影响Table 1 The effect of different solids content on the various indicators of hydrolyzed protein powder from silver carp

2.2.3 进风温度的确定 进风温度对鱼蛋白粉品质的影响见表2。由表中可知，随着进风温度由160℃升高到200℃，粉的白度由92.33下降到85.67，粉的分散性逐渐由不可测改善到59s，流动性由59.8s下降到26.6s，润湿性由61s下降到26s，但温度变化对堆积密度的影响不明显。在相同进风量条件下，干燥室的温度越高，物料进入降速干燥阶段时间就越早，对应的干燥产品的含水量就越低，但是当进风温度高于190℃时，影响蛋白粉品质。当进风温度低于170℃时，鱼蛋白粉的水分含量高于5%。因此，喷雾干燥进风温度控制在170～180℃为佳。

表2 进风温度对鱼蛋白粉各项指标的影响Table 2 The effect of inlet air temperature on the various indicators of hydrolyzed protein powder from silver carp

2.2.4 进料速度的确定 进料速度对鱼蛋白粉品质的影响见表3。由表中可知，随着进料速度由6mL/min增加到14mL/min，产品的水分含量由3.06%升高到5.23%，堆积密度由0.235g/mL增加到0.313g/mL，休止角变从54.8°下降到41.2°，说明产品流动性变好，但是对白度的影响不明显。这是由于进料速度直接影响出风温度。进料速度越大出风温度越低，而过低的出风温度(过高的进料速度)将导致终产品水分含量高，分散性差，结团严重。但是出风温度过高(进料速度过低)会使蛋白粉容易焦糊。综合考虑，进料速度控制在10～12mL/min较适宜。

表3 进料速度对鱼蛋白粉各项指标的影响Table 3 The effect of feed velocity on the various indicators of hydrolyzed protein powder from silver carp

2.3 酶法制备鱼蛋白粉与均质鱼蛋白粉的品质比较

将酶法制备鱼蛋白粉与均质鱼蛋白粉的品质进行比较，结果见表4。由表中可以看出，酶法制备鱼蛋白粉的品质明显优于均质鱼蛋白粉。酶法制备鱼蛋白粉的溶解度达到98.52%，明显高于均质鱼蛋白粉的37.23%。酶法制备鱼蛋白粉的分散性和润湿性有了很大的提高，分散性从无法分散提高到70s，润湿性从262s提高到40s。

表4 酶法制备鱼蛋白粉与均质鱼蛋白粉的品质比较Table 4 The difference of hydrolyzed protein powder and protein powder

2.4 鱼蛋白粉氨基酸组成

酶法制备鱼蛋白粉与均质鱼蛋白粉的氨基酸组成见表5。由表中可知，酶法制备鱼蛋白粉的氨基酸组成优于均质鱼蛋白粉。酶法制备鱼蛋白粉的必需氨基酸含量达到40%以上，超过 FAO/WHO/UNU(2007)推荐值，可以作为很好的蛋白质配料。鱼蛋白粉中赖氨酸含量较高，适合添加在我国大部分人口的谷物食物中以补充赖氨酸，同时还可以提高食物蛋白质的吸收和利用，达到均衡营养，促进生长发育的目的。此外，鱼蛋白粉中组氨酸含量较高，可以考虑将其添加在婴幼儿食品中。

表5 两种鱼蛋白粉的氨基酸组成比较(g/100g蛋白质)Table 5 The comparison of amino acid composition of hydrolyzed protein powder and protein powder(g/100g protein)

3 结论

3.1 白鲢鱼采肉后经打浆被木瓜蛋白酶酶解，在温度50℃、加酶量4000U/g蛋白质、底物浓度为5.5%、pH6.5、时间4h的工艺条件下鱼蛋白质的水解度达到29.82%，其中相对分子量1000以下的组分占90.90%。

3.2 白鲢鱼蛋白酶水解液经浓缩至25%～30%后，采用喷雾干燥控制进风温度170～180℃、出风温度80～90℃，所制备的鱼蛋白粉产品呈乳白色，流动性好、易润湿，溶解度达98.52%。

3.3 酶法制备的鲢鱼蛋白粉鱼蛋白粉必需氨基酸含量达到40%以上，赖氨酸含量较高，是一种营养价值高的优质蛋白，可作为蛋白质功能性食品配料。

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