皮蛋蛋白挥发性风味物质分析

赵 燕，涂勇刚，邓文辉，李建科，王俊杰，罗序英

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047;2.南昌大学生物质转化教育部工程研究中心，江西南昌330047;3.江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045)

皮蛋是我国特有的传统蛋制品，具有悠久的加工历史。除了和鲜蛋一样含有丰富的蛋白质、氨基酸和脂肪酸以外，还有许多特有的品质，如风味独特、色泽美观、易被人体消化吸收等［1］。而且还有平肝、清凉、明目的功效，因此深受国内外消费者的喜爱。不同种类的禽蛋风味有所不同，各种蛋加工制品的风味也各具特色。目前，关于鲜鸡蛋风味物质的鉴定［2］、不同饲料添加物对鲜鸡蛋黄风味的影响［3］及蛋黄蛋白不同配比对炒鸡蛋感官及风味造成极大的差异［4］等皆有报道，但是关于皮蛋中风味物质的研究却不多。皮蛋是一种主要由碱腌制而成的蛋制品，风味独特，蛋黄中的挥发性成分对皮蛋风味起着极其重要的作用［5］，蛋白中的挥发性成分对皮蛋风味的影响却未探究。一般挥发性风味物质的含量甚微，所以较难富集。同时蒸馏萃取(simultaneous distillation extraction，SDE)是一种新的富集技术，其工作原理是经过加热使萃取溶剂蒸气和含有样品组分的水蒸气在装置中充分混合，冷凝后两相充分接触实现组分的相转移，在反复循环中实现高效的萃取［6］。与一些传统的挥发性风味物质的浓缩富集方法如液－液萃取法、顶空法、吹扫捕集法等［7］相比，SDE具有设备简单、操作方便、萃取效率高、成本较低［8］等优点，已被广泛用于风味物质的提取富集［9－11］。本实验采用同时蒸馏萃取与气相色谱－质谱(gas chromatography－mass spectrometry，GC－MS)联用技术，选取蒸馏萃取温度、时间以及萃取溶剂用量三个对萃取结果影响较大的因素进行探讨，优化蒸馏萃取条件，同时用GC－MS法对皮蛋蛋白以及新鲜鸭蛋蛋白中的挥发性风味物质进行定性分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

皮蛋 自制;二氯甲烷(色谱纯)、无水硫酸钠(分析纯，用前干燥处理) 天津市永大化学试剂有限公司;氮气(纯度99.999%) 华东特种气体有限公司。

同时蒸馏萃取装置;GC－2014C气相色谱 日本岛津公司;6980N－5973i气－质联用仪 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 称取皮蛋蛋白10g，匀浆均匀后置于500mL烧瓶中，加入150mL蒸馏水，连接至蒸馏装置的一端，用加热套控制温度100℃;另一端连接盛有二氯甲烷的烧瓶，水浴加热，连续提取一段时间。提取结束后静置5min，加入无水硫酸钠除去水分，过滤。将滤液用 N2吹至0.2mL左右，GC－MS检测。

鲜鸭蛋蛋白挥发性风味物质同上法制备。

1.2.2 SDE法提取挥发性风味物质的条件优化 取皮蛋蛋白10g，在水溶液100℃、二氯甲烷作为萃取溶剂的条件下对蒸馏萃取温度、时间、萃取溶剂用量进行优化。

1.2.3 色谱条件 色谱柱:HP－5毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm);升温程序:起始温度 50℃，保持1min，以 7℃ /min 升温到 220℃，保持 10min，再以20℃/min升温到 280℃，保持 10min;进样口温度250℃;载气 He，流速 1.0mL/min;进样量 1.0μL，不分流进样。

质谱条件:离子源温度 230℃，传输线温度230℃，电离方式电子电离(electron ionization，EI)，电子能量 70eV，灯丝电流 150μA，扫描质量范围30～450u。

2 结果与分析

2.1 SDE法提取条件优化

影响SDE萃取效率的主要因素有萃取溶剂的种类和用量、循环蒸馏－萃取的时间、温度等［12］。二氯甲烷、三氯甲烷、正戊烷、异戊烷等［13－14］都可以作为SDE的萃取溶剂。因二氯甲烷沸点较低，密度较大，对半挥发性及挥发性组分都有较好的萃取效果，是一种较为常用的理想的萃取溶剂［10，15］，所以本实验选择二氯甲烷为萃取溶剂，并考察蒸馏萃取温度、时间以及二氯甲烷的用量对皮蛋蛋白挥发性风味物质萃取效果的影响。

2.1.1 循环蒸馏萃取温度的选择 萃取溶剂和水溶液的温度都会对蒸馏萃取结果产生很大的影响。虽然提高样品与水的混合溶液的温度有助于增强组分的蒸馏效率［16］，特别是对低挥发性组分的影响更为明显。但是温度越高，样品发生如热解、氧化及不稳定物质间相互反应等副反应的几率也就越大，对样品中不稳定组分的影响尤为明显，对结果准确性的影响也就越大。所以实验中选取混合溶液的温度为水溶液的沸腾温度 100℃。许多研究［10，17－18］中选用二氯甲烷作为萃取剂时一般将其蒸馏温度控制在50～60℃，所以本实验在水溶液温度100℃、萃取时间1.5h、萃取溶剂60mL的条件下，考察了45、50、55、60、65℃的溶剂温度对萃取效果的影响，结果见图1。

图1 蒸馏萃取温度对萃取效果的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction efficiency of volatile flavor compounds

由图1可知，溶剂温度在45～55℃时，随着温度的升高，峰的个数随之增多，当溶剂的温度继续升高时，峰数目开始减少，不过峰面积则一直呈增加趋势。刚开始温度升高，溶剂循环的速度随之加快，与水蒸气接触的次数也就增多，萃取效果也就越来越好。但当蒸馏温度继续升高时，在萃取溶剂中的一些不稳定物质可能会发生反应，如酸和醇发生的酯化反应等，引起了峰数目的减少，由于实验中峰面积不会对结果的定性分析产生较大的影响，所以实验选取55℃为溶剂萃取温度。

2.1.2 循环蒸馏萃取时间的选择 循环萃取时间是影响萃取效率的又一重要因素［19］，许多实验中选取1～4h作为蒸馏萃取时间［15，20－21］。本实验在水溶液100℃、萃取溶剂55℃、萃取溶剂60mL的条件下，考察 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h 对萃取效果的影响，结果见图2。

图2 蒸馏萃取时间对萃取效果的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction efficiency of volatile flavor compounds

由图2可以看出，萃取时间由1.0h增加至1.5h时，峰数目、峰面积都有所增加，但随着时间的继续延长，峰数目和峰面积都呈下降趋势。这可能是由于不同物质与萃取溶剂之间存在平衡，而不同物质的挥发性不同。易挥发性组分极易被蒸馏、萃取，在1.5h内即可达到平衡，但随着萃取时间的延长，它们会从萃取溶剂蒸气中被再次蒸馏，有的甚至会完全消失［22］。同时，随着循环萃取时间的延长，由于一些不稳定化合物之间发生副反应降低了其萃取效率。当萃取时间为1.5h时峰数目最多，所以实验选取1.5h为蒸馏萃取时间。

2.1.3 溶剂用量的选择 萃取溶剂的用量会影响待测组分在萃取液中的最后浓度，同时又决定了蒸馏速度［18］。增加萃取溶剂的用量可能有利于提高萃取效率。但是由于在后续的色谱分离测定时需要将SDE所得到的有机相收集液经浓缩至0.2mL左右，较大的溶剂用量会造成浓缩时间的延长，对易挥发化合物会有一定的损失，从而影响测定结果的准确性。实验中在水溶液100℃、萃取温度55℃、萃取时间1.5h 的条件下分别对 40、50、60、70、80mL 五个溶剂用量进行考察，结果见图3。

图3 萃取溶剂体积对萃取效果的影响Fig.3 Effect of solvent volume on extraction efficiency of volatile flavor compounds

文献［12，19］报道，萃取溶剂的用量会对萃取率产生较大影响，但本实验中却并未观察到明显的现象。由图3可知，随着溶剂用量的增大，萃取率并没有呈单一的升高或降低趋势。但在后续溶剂浓缩过程中，很可能会造成易挥发化合物的较大损失，从而影响检测结果。溶剂过少或过多都会增加检测结果不准的几率，实验选取60mL为溶剂体积。

2.2 皮蛋蛋白中挥发性风味成分的分析

图4为在最优提取条件下皮蛋蛋白中挥发性风味物质总离子流图(并与鲜鸭蛋蛋白作对比)，用GC－MS对两种蛋白的风味成分进行鉴定，结果见表1。由表1可知，皮蛋蛋白中共鉴定出26种风味物质:其中脂肪烃类8种(相对含量32.671%)，醇类1种(相对含量 0.694%)，醛类 3种(相对含量1.558%)，酮类2种(相对含量0.812%)，酯类5种(相对含量 44.818%)，芳香烃类 2种(相对含量14.94%)，酚类2种(相对含量1.061%)，含硫化合物类2种(相对含量1.809%)及胺类物质1种(相对含量1.638%);鲜鸭蛋蛋白中鉴定出27种物质，其中脂肪烃类9种(相对含量36.544%)，醇类1种(相对含量1.238%)，酮类1种(相对含量0.35%)，羧酸类2种(相对含量 1.549%)，酯类 4种(相对含量28.077%)，芳香烃类3种(相对含量20.9%)，酚类2种(相对含量2.67%)，含硫化合物类3种(相对含量4.028%)及胺类物质2种(相对含量4.641%)。

图4 皮蛋蛋白和鲜鸭蛋蛋白中挥发性风味物质总离子流图Fig.4 GC－MS total ion current chromatogram of volatile flavor constituents from preserved egg white and fresh duck egg white

表1 皮蛋蛋白和鸭蛋蛋白中挥发性风味物质的GC－MS分析结果Table 1 GC－MS analytical results of volatile flavor compounds of preserved egg white and fresh duck egg white

续表

两种蛋白中共同含有的物质17种，其中脂肪烃类6种(苯乙烯、癸烷、十二烷、十四烷、二十烷、1，54－二溴－五十四烷)，酮类1种(7，9－二叔丁基－1－氧杂螺［4，5］－6，9－壬二烯－2，8－二酮)，酯类 3 种(邻苯二甲酸二异丁酯、L－抗坏血酸－2，6－二棕榈酸酯、邻苯二甲酸二辛酯)，芳香烃类2种(间二甲苯、萘)，酚类2种(苯酚、2，6－二叔丁基对甲酚)，含硫化合物2种(环8原子硫、二－(1，1－二甲基癸基)二硫)，胺类1种(芥酰胺)。

在皮蛋蛋白中，酯类的含量最多(相对含量44.818%)，且大多是短链脂肪酸酯，它们都有其独特的水果风味，因此它们对皮蛋蛋白风味的形成有重要的作用。如邻苯二甲酸二辛酯可能有黄杏味［23］、L－抗坏血酸－2，6－二棕榈酸酯可能具有芳香味等［24］。而鲜鸭蛋蛋白中含酯量则相对要少(相对含量28.077%)，同时在种类上也少于皮蛋蛋白中的，这可能是二者风味不同的重要因素之一。

在鲜鸭蛋蛋白中含有两种羧酸类物质，不含醛类物质;相反的，在皮蛋蛋白中含有三种醛类物质，不含羧酸类物质。在挥发性物质中，羧酸主要来自于中性脂肪和磷脂的降解，它们对风味有着较大的影响，特别是一些短链脂肪酸，由于它们嗅觉阈较低，且本身具有特有风味，对整体风味影响更甚。如壬酸具有脂肪香味，十二酸可能具有蜡香等。一般在挥发性风味物质中，6个碳原子以上的饱和醛，阈值很低，会对风味产生很大的影响。短链醛可能具有清香、油香、脂香及强烈的刺激性气味;分子量较高的醛可能具有橘子皮似的风味［25］。如壬醛有水果清香和脂香，癸醛具有刺激性气味等。醛类物质可能是造成两种蛋白风味不同的又一重要因素。

在两种蛋白中都含有少量的酮类物质，虽然它们种类较少，阈值较高，对风味特征的贡献不太大，但有些酮类对于杂环化合物的形成有重要的作用，是其重要的中间体，对香味的形成起着不可忽视的作用［26］。关于其来源，一方面可能来源于脂肪氧化，另一方面可能来源于脂肪热降解，氨基酸的降解及美拉德反应［27］等。

在两种蛋白中还含有少量的醇类物质，虽然它们含量也不高，但是由于其是长链或者不饱和醇类，自身具有特有风味，而且它们阈值较低，对风味形成的作用可能较大。2，2，4－三甲基－3－(3，8，12，16－四甲基－十七碳－3，7，11，15－四烯)－环己醇可能表现出清香、木香、脂肪香的特征［28］，2，6，10，15，19，23－六甲基－2，6，14，18，22－五烯基－二十四－10，11－二醇可能具有蘑菇香味［29］。

在两种蛋白中都含有一些脂肪烃类。不过脂肪族烃类阈值较高，它们对风味贡献应该较小［30］。

在皮蛋蛋白中含有2种含硫化合物，1种胺类化合物;鲜鸭蛋蛋白中含有3种硫化物，2种胺类化合物。虽然它们种类和含量都不是很多，但是由于这些含硫化合物和胺类化合物的阈值很低，而且硫化物具有如硫样香气、洋葱样香气以及辛辣等独特的浓厚气味［31］，噻唑类化合物具坚果香［32］，很大程度的影响着整个风味。鲜鸭蛋蛋白比皮蛋蛋白多1种硫化物和1种胺类化合物，而且鲜鸭蛋中这些胺类化合物的含量高于皮蛋中的含量，这就可能一定程度上决定了2种蛋白的特有风味。

3 结论

对同时蒸馏萃取条件进行优化，结果表明，在蒸馏萃取时间1.5h、水溶液温度100℃、溶剂温度55℃、萃取溶剂用量60mL的条件下，皮蛋蛋白中挥发性风味物质的提取富集效果最好。

采用气相色谱－质谱联用仪分析了皮蛋蛋白与新鲜鸭蛋蛋白经同时蒸馏萃取富集后的挥发性风味物质。皮蛋蛋白中测定出26种物质，其中脂肪烃类8种，醇类1种，醛类3种，酮类2种，酯类5种，芳香烃类2种，酚类2种，含硫化合物类2种及胺类物质1种;鲜鸭蛋蛋白中鉴定出27种物质，其中脂肪烃类9种，醇类1种，酮类1种，羧酸类2种，酯类4种，芳香烃类3种，酚类2种，含硫化合物类3种及胺类物质2种。

皮蛋蛋白和鲜鸭蛋蛋白中共有的挥发性风味物质有17种，其他部分不相同，说明腌制过程使鸭蛋蛋白中的挥发性风味物质发生了较大的变化。

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