囊胚注射大鼠多能干细胞在小鼠体内产生大鼠胰腺

Kobayashi T 论著 路君 编译

利用患者自身的多能干细胞、突破器官形成障碍、体外构建完整的器官是再生医学研究领域的最终目标。随着诱导多潜能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）技术的发展，人们已经可以获得患者的iPSC。虽然体细胞重编程还存在潜在分险，但真正的挑战是建立一种器官形成的方法。体外实现器官再造相当复杂，囊胚互补技术是实现这一目标的方法之一。囊胚互补最早由Chen等报道，他们的研究证明Rag2-/-小鼠在囊胚期将野生型小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell，mESC）注射到内细胞团，发育出表型正常的小鼠。Rag2基因敲除引起小鼠胚胎发育过程中T、B淋巴细胞系缺失，小鼠体内T、B淋巴细胞完全由野生型mESC发育而来。Nakauchi研究小组认为，可以在基因敲除而造成器官发育缺失的模型动物中复制这一现象，因此他们关注到胰腺及胰腺发育相关转录因子Pdx1。胰腺和十二脂肠同型盒基因（pancreatic and duodenal homeobox1，Pdx1）在胰腺发育和β细胞分化中发挥重要作用。Pdx1基因敲除小鼠出生后因胰腺缺失死亡。Nakauchi研究小组假设Pdx1-/-小鼠发育过程中因没有胰腺器官而营造了一个“发育微环境”，注射多潜能干细胞（pluripotent stem cell，PSC）可形成完全由 PSC来源的、功能正常的胰腺。他们共设计了3组实验证明这种囊胚互补性。

研究的第一个目标是在Pdx1基因敲除小鼠中获得小鼠PSC（mPSC）来源的胰腺。用于注射囊胚的细胞有mESC和GT3.2小鼠iPSC。通过显微注射将GT3.2miPSCs注入Pdx1-lacZ Knockin 小鼠（Pdx+/-）配对产生的子代囊胚中。结果显示囊胚注射后出生的各基因型小鼠都有胰腺器官，其中也包括Pdx1-/-新生小鼠。Pdx+/-和Pdx+/+小鼠胰腺由自身细胞及外源EGFP-miPSC或mESC共同分化而来，与嵌合体动物身体其他各器官一致。嵌合的Pdx-/-小鼠胰腺形状和组织学检测均正常，胰腺细胞（外分泌、内分泌和导管上皮细胞）皆来源于EGFP-miPSC或mESC，但胰腺中的血管、神经和成纤维细胞则由自体及外源细胞共同发育而来。Pdx1-/-嵌合小鼠可存活至成年，GTT实验结果表明Pdx1-/-嵌合小鼠胰岛素分泌在高血糖时增加，血糖和正常小鼠类似。STZ诱导C57BL/6小鼠发生糖尿病，从表达EGFP的miPSC来源胰腺中分离的胰岛移植在糖尿病小鼠肾包膜下。2个月后依然可以在移植处检测到表达EGFP的miPSC来源的胰岛细胞。移植后的糖尿病小鼠血糖能够恢复正常，葡萄糖耐量（glucose tolerance testing，GTT）实验结果与正常小鼠相似。这部分研究结果表明，发育过程中某个器官缺失能营造出一个微环境（Pdx1-/-小鼠和胰腺缺失微环境）。PSC来源细胞可以代偿的占据这个微环境，形成一个几乎由供方PSC发育而来的器官。

研究的第二个目标是得到小鼠和大鼠的种间嵌合体。将EGFP标记的GT3.2 miPSC注射到大鼠囊胚，或将EGFP标记的大鼠iPSC（riPSC）注射到小鼠囊胚，注射的小鼠或大鼠iPSC能够参与异基因动物的胚胎发育并产生种间嵌合体动物。嵌合的PSC分布在全身各器官，且具有正常功能。种间嵌合动物中异基因来源细胞比例明显低于种内嵌合，大鼠或小鼠嵌合体的检测结果均一致。大鼠母亲生育的嵌合体动物形态与新生大鼠相似，而由小鼠母亲生育的则形态类似于正常的新生小鼠。异源细胞的贡献率会影响嵌合动物体型。组织免疫染色的结果可见EGFP阳性细胞存在于多种组织和器官中，但异种细胞未参与种间嵌合体动物的生殖细胞分化。大鼠没有胆囊，而小鼠有胆囊。当mPSC注入大鼠囊胚产生的种间嵌合体（与大鼠体型相似）没有胆囊，相对的rPSC注入小鼠囊胚产生的嵌合体（体型与小鼠相似）有胆囊。

研究的第三个目标是，通过囊胚注射在Pdx1-/-小鼠体内产生异基因的大鼠胰腺。riPSC作为供方细胞，囊胚注射后139个胚胎种植在假孕小鼠子宫，34个小鼠出生。Pdx1-/-种间嵌合体胰腺几乎都是EGFP阳性细胞。经免疫组织荧光检测发现表达EGFP的riPSC来源的胰腺细胞可共表达α-淀粉酶（外分泌标志基因）、胰岛素、胰高血糖素和生长素（内分泌标志基因）。嵌合riPSC的Pdx1-/-小鼠能生长至成年（8周），胰腺中绝大部分细胞为EGFP阳性细胞。成年小鼠的GTT实验中，可见葡萄糖升高引起胰岛素分泌增加。这部分结果表明注射riPSC到Pdx1-/-小鼠胚胎成功的创造出拥有大鼠胰腺的嵌合小鼠，该技术被称为“种间囊胚互补”。

有研究报道过类似的技术，如胸腺上皮发育、心脏缺损修复、卵巢造血细胞及生殖细胞的克隆研究，但是没有研究曾证明外源细胞可形成完整的器官，弥补发育中的致死性缺陷，使嵌合体动物存活至成年。目前，体外将PSC分化为胰岛素分泌细胞的方法主要是采用多步诱导的方式。然而体外诱导的方法还有待于改进，胰岛素分泌量及葡萄糖响应方面仍需提高，且未分化的iPSC还有引起畸胎瘤的风险。本研究通过囊胚互补的方法在体内形成胰腺，模拟了近于正常的发育过程和表观遗传改变，逆转录病毒感染诱导的iPSC成瘤风险还需长期观察。

本研究成功的在Pdx1-/-小鼠中获得功能正常的大鼠胰腺。所有注射riPSC的Pdx1-/-小鼠囊胚出生后都有胰腺组织，尽管只有部分嵌合体动物能活到成年，成年动物riPSC来源的胰腺形态和组织学正常，未出现糖尿病症状，GTT结果表明胰腺功能良好。已往研究表现在异基因环境中可以形成有功能的细胞（精子、肝细胞），不过此前没有在异基因环境中PSC形成器官并能够拯救致死性突变至成年的报道。这种器官再造模式有望用于在猪或其他大型动物体内产生人的器官，但是要将此技术用于临床还有许多的难题需要克服。本研究获得了小鼠和大鼠的嵌合体动物，但这一过程中的胚胎致死率高、成年动物存活率低。猪或绵羊与人的胚胎发育存有很大差异，可能难以实现囊胚互补。另外一个问题就是PSC来源的细胞不仅存在于胰腺，还存在于包括脑和生殖腺的所有器官，尚没有适合控制PSC分化的方法，因此这种在牲畜体内获得人类器官的方式面临严峻的伦理质疑。

综上所述，该研究向人们描绘了一种实现再生医学终极目标的可能途径。