骨髓增殖性肿瘤伴骨纤巨核细胞形态及BCR-ABL、JAK2V617F基因的相关性研究

梁志鹏 杨波 杨英

骨髓增殖性肿瘤伴骨纤巨核细胞形态及BCR-ABL、JAK2V617F基因的相关性研究

梁志鹏 杨波 杨英

目的 探讨和了解骨髓巨核细胞异形性改变在CML、ET、PV伴骨髓纤维组织增生中的诊断意义，分析BCR-ABL融合基因和JAK2V617突变对巨核细胞形态的影响及临床意义。方法收集山西医科大学第二临床医学院2009年1月至2012年8月诊治的CML、ET、PV患者的外周血常规检查和骨髓活检切片资料并进行回顾性分析，将骨髓巨核细胞形态分为七类，分别为Ⅰ型（单个核型）、Ⅱ型（多个核型）、Ⅲ型（多分叶型）、Ⅳ型（分叶不好型）、Ⅴ型（大核小核型）、Ⅵ型（巨核细胞簇）、Ⅶ型（骨小梁旁型）。观察骨髓切片中巨核细胞，通过卡方检验方法分析CML融合基因B3a2、B2a2，ET、PV JAK2V617F突变对巨核细胞形态影响的差异。结果各组巨核细胞均伴异形性改变，CML B3a2-1与B3a2-0、ET JAK2V617F(-)-1与JAK2V617F(-)-0、PV组巨核细胞差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。骨小梁旁巨核细胞在ET JAK2V617F（+）-1与JAK2V617F（+）-0组有统计学差异（P = 0.000）、巨核细胞簇分别在CML B2a2-1与B2a2-0组、ET JAK2V617F（+）-1与JAK2V617F（+）-0组有统计学差异（P = 0.024,0.030）。结论CML-B2a2型、ET、PV中JAK2V617F突变伴骨髓纤维组织率高。巨核细胞簇和骨小梁旁巨核细胞、巨核细胞簇分别对B2a2、JAK2V617F突变伴骨纤程度轻微时有一定的早期诊断意义。

慢性粒细胞白血病； 血小板增多症； 真性红细胞增多症； 骨髓纤维组织增生； 骨髓巨核细胞

骨髓增殖性肿瘤（chronicmyeloproliferative neoplasm，MPN）是一组以融合基因BCR-ABL和JAK2V617F突变为特点的造血干细胞异常增殖性肿瘤，如慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）、真 性 红 细 胞增多症（polycythemia vera，PV）、骨髓纤维化（myelofi brosis，MF）、原发性血小板增多症（essentia thrombocythemia，ET）。 在CML、ET、PV后期往往伴有骨髓纤维组织增生，在骨髓中以异形性巨核细胞的增多为特征［1-2］。相关研究表明骨髓纤维组织增生是预后不良的标志且治疗困难。本研究通过观察骨髓巨核细胞异形性改变，分析BCR-ABL融合基因和JAK2V617F突变在CML、ET、PV伴骨髓纤维组织增生中的相关性，探索其在临床早期诊断中的意义。

资料与方法

一、研究对象

收集2009年1月至2012年8月在山西医科大学第二医院确诊为MPN（CML、ET、PV）的门诊和住院患者165例，男81例，女84例，中位年龄52岁。其中CML患者55例，男30例，女25例，中位年龄52岁，CML融合基因B3a2型20例，伴骨髓纤维组织增生13例，B2a2型30例，伴骨髓纤维组织增生24例；ET患者79例，男32例，女47例，中位年龄54岁，JAK2V617F突变者46例；PV患者31例，男19例，女12例，中位年龄57岁，JAK2V617F突变者23例。诊断参考2008年WHO造血与淋巴组织肿瘤分类方案［3］。

二、研究方法

1.巨核细胞分类：观察骨髓病理活检切片中巨核细胞形态并分类。参考文献[4]提出的分型标准，分为Ⅰ型（单个核型）、Ⅱ型（多个核型）、Ⅲ型（多分叶型）、Ⅳ型（分叶不好型）、Ⅴ型（大核小核型）、Ⅵ型（巨核细胞簇）、Ⅶ型（骨小梁旁型）。以上观察和判断均在2位经验丰富的形态学专业人员的辅助下完成。

2.网状纤维的分布：观察经Gomori染色的骨髓切片，参考文献[5]分级标准，骨纤程度分为-、+、++、+++、++++级。骨纤程度≥++为伴骨髓纤维组织增生。

3.分组：将CML患者分为B3a2-0、B3a2-1；B2a2-0、B2a2-1。其中B3a2、B2a2分别代表BCR-ABL融合基因的亚型（0代表不伴骨髓纤维组织增生，1代表伴骨髓纤维组织增生）。将ET和PV患者分为J AK2V617F（-）-0、JAK2V617F（-）-1；JAK2V617F（+）-0、JAK2V617F（+）-1。其中JAK2V617F（-）代表无突变，JAK2V617F（+）有突变，0代表不伴骨髓纤维组织增生，1代表骨髓纤维组织增生。

三、统计学分析方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，各组异型巨核细胞分布、骨纤维组织等级指标用相对数表示，组间差异采用秩和检验和精确概率法卡方检验；外周血细胞数采用±s表示，其不同类型组间差异采用独立t检验，以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、外周血常规结果

CML B3a2伴骨髓纤维组织增生患者血红蛋白降低，有统计学差异（t = 2.920，P = 0.009），CML B2a2、ET和PV等组血红蛋白、白细胞、血小板差异无统计学意义（P ＞ 0.05，表1）。

二、骨髓纤维组织增生率

CML融 合 基 因B2a2、B3a2，ET和PV JAK2V617F阴性、阳性患者伴骨髓纤维组织增生率分别为80﹪、65﹪；21.9﹪、45.7﹪；0﹪、47.8﹪。骨纤程度以++ ～ +++为主（表2）。

三、骨髓巨核细胞异形性

观察各组巨核细胞均伴有异形型改变，其中巨核细胞簇、骨小梁旁细胞和巨核细胞簇分别在CML B2a2组、ET伴JAK2V617F组中差异有统计学意义（图1，表3）。

表1 MPN各组外周血常规比较

图1 在Olympus BX-51光学显微镜下观察骨髓切片中巨核细胞异形性改变

表2 不同类型MPN患者骨纤等级分布例数

讨 论

CML、ET、PV发展过程中常伴有骨髓纤维组织增生，在疾病的晚期，骨髓巨核细胞的数量和形态也随之发生改变。2008年WHO诊断标准将骨髓巨核细胞增殖和异形性改变伴网硬蛋白纤维化作为骨纤的首要诊断标准[3]，Thiele等[6]认为异常形态的巨核细胞在伴骨髓纤维组织增生患者较多见，巨核细胞多形性改变的程度加重往往提示疾病预后不良。正确判断骨髓纤维组织增生的程度对临床治疗方案的选择与预后评估的相关研究日益受到重视[5]。

巨核细胞由骨髓造血干细胞分化而来，某些血液病（如MDS、CML、ET）伴有巨核细胞形态改变，出现病态巨核细胞[7]。在骨髓片中检出病态巨核细胞，标志着骨髓巨核细胞存在成熟障碍和病态造血，它的数量则反映了巨核细胞病态造血的严重程度[7]。异形性巨核细胞的数量增多亦是CML、ET、PV向骨髓纤维化发展的形态学特征[2]。正常巨核细胞分布在骨小梁间区的窦状结构旁，不发生成簇分布，巨核细胞成簇现象可以评估骨髓巨核细胞的显著性增生或异常增殖。正常情况下，巨核细胞散在性定位于造血组织，当骨髓增殖性肿瘤时，可移位于骨小梁旁区[2，4]。单个核、多个核常出现在CML加速期和急变期中。巨大多分叶巨核细胞也可在PV中观察到，但并非ET所特有。大核小核型，是巨核细胞核分裂或分离形成。分叶不好型最不特异，可能是几个核的重叠，良、恶性疾病中都可以出现[4]。以上巨核细胞异形性改变及分布与本研究结果相近。

表3 MPN各组异形性巨核细胞分布情况例数

JAK2V617F突变是诊断BCR-ABL阴性MPN新增加的一项指标[3]。Kralovics定量分析JAK2V617F突变的纯合子型骨髓增生性肿瘤患者具有较高的骨髓纤维化发生率[8-9]，其机制尚未明了。而本研究采用定性分析发现伴JAK2V617F突变的ET和PV患者也具有较高的骨纤发生率。此外，本研究中有12例ET、2例PV骨纤程度为+++ ～ ++++，而Swerdlow等[10]报道ET的网状纤维正常或轻微增多（＜ ++），国际MPN研究和治疗工作组（international working group for MPN research and treatment，IWG-MRT）将骨纤等级+++ ～ ++++作为诊断post-ET MF/ post-PV MF的主要标准之一。post-ET MF/post-PV MF与MF临床特点相似，都具有较高的转白率[11]，可以为临床分期提供有价值的实验依据。文献报道CML融合基因B2a2易发生急髓变，B3a2易发生急淋变[12]，且B2a2、B3a2与患者病程、生存期及骨纤发生率无关。而本研究还观察发现到B2a2患者骨纤发生率高、异形性巨核细胞较多见，提示预后不良。本研究的结果显示CML融合基因B2a2、ET伴JAK2V617F突变的伴骨髓纤维组织增生骨髓中巨核细胞成簇现象易出现。另外在伴JAK2V617F突变的伴骨髓纤维组织增生的ET骨髓中易见到巨核细胞移位于骨小梁旁，推测B3a2患者的预后可能优于B2a2患者，JAK2V617F未突变的ET患者优于突变者。文献报道BCR-ABL是在P210蛋白水平影响CML的发生，未涉及到巨核系；野生型JAK2V617F通过激TPO的受体MPL使巨核细胞分化成熟[13]。Pich等[14]和Campbell等[15]研究认为 JAK2V617F突变与骨纤程度、巨核细胞簇无相关联系，而Ciurea等[16]和Kilpivaara等[17]在基因敲出的老鼠培养中发现JAK2V617F突变与巨核细胞成簇现象的发生有关，与骨纤程度无明显相关性。虽然本研究观察的异形性巨核细胞在ET JAK2V617F阴性和PV伴骨髓纤维组织增生中均可见到，但受随访例数限制，应还需增大样本数量进一步证实其与骨髓纤维组织增生的相关性。

本文研究的单个核、多个核、多分叶、分叶不好、大核小核型巨核细胞在伴骨髓纤维组织增生的骨髓组织切片中均可见到，结合相关基因的诊断，可以更好地为早期骨髓纤维化诊断提供线索。骨髓纤维化后期常表现为骨髓衰竭及较高的转白率[11]，通过观察异形性巨核细胞有助于早期追踪骨髓纤维组织增生的发展，可为临床治疗方案的选择提供诊断学基础。

1 Michiels JJ, De Raeve H, Hebeda K, et al. WHO bone marrow features and European clinical, molecular, and pathological (ECMP) criteria for the diagnosis of myeloproliferative disorders[J]. Leuk Res, 2007, 31(8):1031-1038.

2 Balduini A, Badalucco S, Pugliano MT, et al. In vitro megakaryocyte differentiation and proplatelet formation in ph-negative classical myeloproliferative neoplasms: distinct patterns in the different clinical phenotypes[J]. PloS One, 2011, 6(6):e21015.

3 Vardiman JW. The world health organization (WHO) classifi cation of tumors of the hematopoietic and lymphoid tissues:an overview with emphasis on the myeloid neoplasms[J]. ChemBiol Interact, 2010, 184(1-2):16-20.

4 卢兴国.骨髓细胞学和病理学诊断[M].北京：科学出版社, 2008:411-441.

5 陈辉树.骨髓病理学[M]. 北京：人民军医出版社, 2010:8-11.

6 Passamonti F, Malabarba L, Orlandi E, et al. Polycythemiavera in young patients:a study on the longterm risk of thrombosis, myelofibrosis and leukemia[J]. Haematologica, 2003, 88(1):13-18.

7 Thiele J, Kvasnicka HM, Orazi A. Bone marrow histopathology in myeloproliferative disorders—current diagnostic approach[J]. Seminars in hematology, 2005, 42(4):184-195.

8 朱蕾,卢兴国,赵小英,等.骨髓涂片和切片中的巨核细胞多形性改变在慢性骨髓增殖性疾病中的诊断意义[J].中华检验医学杂志, 2010, 33(2):143-148.

9 Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, et al. A gain-offunctionmutation of JAK2 in myeloproliferative disorders[J]. N Engl J Med, 2005, 352(17):1779-1790.

10 Passamonti F. Prognosticfactors and models in polycythemiavera, essential thrombocythemia, and primary myelofibrosis[J]. Clin Lymphoma Myeloma Leuk, 2011,Suppl 1:S25-727.

11 Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. World health organization classifi cation of tumours of the haematopietic and lymphoid tissues[M]. Lyon:Interationl Agency for Research on Cancer, 2008:31-64.

12 Tefferi A. Polycythemia vera and essential thrombocyt hemia:2012update on diagnosis, risk stratification, and management[J]. Am J Hematol, 2012, 87(3):285-293.

13 Polampalli S, Choughule A, Negi N, et al. Analysis and comparison of clinicohematological parameters and molecular and cytogenetic response of two Bcr/Abl fusion transcripts[J]. Genet Mol Res, 2008, 7(4):1138-1149.

14 Pich A, Riera L, Sismondi F, et al. JAK2V617F activating mutation is associated with the myeloproliferative type of chronic myelomonocytic leukaemia[J]. J ClinPathol, 2009, 62(9):798-801.

15 Campbell PJ, Scott LM, Buck G, et al. Definition of subtypes of essential thrombocythaemia and relation to polycythaemia vera based on JAK2V617F mutation status: a prospective study[J]. Lancet, 2005, 366(9501):1945-1953.

16 Ciurea SO, Merchant D, Mahmud N, et al. Pivotal contributions of megakaryocytes to the biology of idiopathic myelofi brosis[J]. Blood, 2007, 110(3):986-993.

17 Kilpivaara O, Mukherjee S, Schram AM, et al. A germline JAK2 SNP is associated with predisposition to the development of JAK2(V617F)-positive myeloproliferative neoplasms[J]. Nat Genet, 2009, 41(4):455-459.

18 Li J, Spensberger D, Ahn JS, et al. JAK2 V617F impairs hematopoietic stem cell function in a conditional knockin mouse model of JAK2 V617F-positive essential thrombocythemia[J]. Blood, 2010, 116(9):1528-1538.

Correlation study of BCR-ABL, JAK-2 and the morphology of the bone marrow megakaryocytes in myeloproliferative neoplasms with myelofibrosis

LIANG Zhi-peng, YANG Bo，YANG Ying. Diagnostic Laboratory, the Second AffiliatedHospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

YANG Bo，Email：ty-yb@sohu.com

ObjectiveTo evaluate the morphologic features of CML, ET and PV with hyperplasia of fibrous tissue and their influence on bone marrow megakaryocytes in patients with BCR-ABL fusion gene and JAK2V617 mutation.MethodsWe retrospectively examined the diagnosis and treatment of CML, ET and PV with hyperplasia of fibrous tissue in our hospital from January 2009 to August 2012. Patients were divided into 7 groups according the types of morphologic features: typeⅠ( single karyotype ), typeⅡ( multiple karyotypes), typeⅢ(multiple split leaf type), typeⅣ (split leaves with poor prognosis),Ⅴ ( big nuclear small nuclear karyotype), typeⅥ(cluster),Ⅶ(trabecular side type). χ2test was used to evaluate the influence of fusion gene subtypes (B3a2, B2a2), ET, PV and JAK2V617 mutations on morphological differences of megakaryocytes.ResultsThe megakaryocytes were morphologically different among the groups. B3a2-1 group and B3a2-0 group were morphologically similar. JAK2V617F (-)-1, JAK2V617F (-)-0 of ET and PV groups were morphologically similar. For patients with cluster of megakaryocytes there was statistically difference between B2a2-1 and B2a2-0.For patients with trabecular side megakaryocyte there was statistically difference between JAK2V617F (+) -1, JAK2V617F (+) -0 of ET (P < 0.05) and JAK2V617F (+) -1 and JAK2V617F (+) -0 of ET (P = 0.024,0.030). Conclusions Incidence of myelofibrosis was higher in patients with fusion gene B2a2. Mgakaryocyte cell cluster is a good indicator of disease in patients with B2a2 and slight hyperplasia of fibrous tissue. In patients with JAK2V617 mutations of ET and PV, trabecular side type and cluster are helpful for early diagnosis.

Chronic myeloid leukemia； Thrombocytosis； Polycythemia vera； Bone marrow hyperplasia of fibrous tissue； Bone marrow megakaryocytes

2012-04-19)

(本文编辑：蔡晓珍)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2013.01.003

030001 太原，山西医科大学第二临床医学院诊断学实验室

杨波，Email：ty-yb@sohu.com

梁志鹏，杨波，杨英. 骨髓增殖性肿瘤伴骨纤巨核细胞形态及BCR-ABL、JAK2V617F基因的相关性研究[J/CD].中华细胞与干细胞杂志：电子版, 2013, 3(1):7-12.