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儿童外周血造血干细胞采集方法与效果评价

2013-12-06殷国美沈卓岚钱文斌

浙江大学学报(医学版) 2013年3期
关键词:分离机血量供者

殷国美,沈卓岚,秦 斐,钱文斌

(1.浙江大学医学院附属第一医院血液科,浙江杭州 310003;2.浙江省血液中心,浙江杭州 310006)

自体和异基因外周血造血干细胞移植(peripheralblood stem celltransplantation,PBSCT)由于造血干细胞采集方便、不需要全身麻醉、移植后造血重建快等优点,已广泛应用于恶性血液病与部分实体肿瘤等疾病的治疗[1-6]。对于儿童 PBSCT,由于其年龄小、体重轻、循环血量少,易发生枸橼酸中毒反应和容量异常反应等;特别是体重<20 kg的小儿,在外周血造血干细胞(PBSC)采集时,还需要维持血液分离过程中的血液动力学稳定性,采集更加困难。浙江省血液中心自2004年10月至今,成功采集儿童外周血造血干细胞31例,现就儿童PBSC的采集方法与效果作一介绍。

1 材料和方法

1.1 病例 2004年10月至2012年4月间,浙江省血液中心采集儿童外周血造血干细胞共31例(浙江大学医学院附属第一医院3例,浙江省肿瘤医院5例,浙江省儿童医院23例)。其中,男15例、女16例,中位年龄10岁(1.4~17岁)。本组病例中自体PBSCT 20例,包括神经母细胞瘤(NB)2例,原始神经外胚层肿瘤(PNET)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性单核细胞白血病(AMoL)和急性早幼粒细胞白血病(APL)各1例,慢性粒细胞性白血病(CML)3例,非霍奇金淋巴瘤(NHL)11例;同种异体PBSCT 11例,受者为CML 2例、ALL 2例、再生障碍性贫血(AA)2例、急性粒-单核细胞白血病(AMMoL)4例、AMoL 1例,供者为异体健康供者,11例中除1例为父子间的半相合移植,其余10例为同胞供者移植。

1.2 仪器 CS-3000 Plus血细胞分离机(美国Baxter公司),包括普通分离槽和小体积收集槽、小体积分离槽和小体积收集槽;6.1版本软件的 COBE Spectra血细胞分离机(美国Caridian BCT公司);COM TEC血细胞分离机(美国Fresenius kabi公司)。

1.3 方法

1.3.1 PBSC动员 ①自体:采用化疗和 GCSF或GM-CSF动员,化疗后WBC数下降至低谷并开始回升时给予G-CSF或GM-CSF 3~5μg/kg,皮下注射,1次/d,待 WBC数回升至 >5.0×109/L时,进行PBSC采集。②异体:单用G-CSF 5 ~10μg/kg,1 次/d,皮下注射,连用5 d后开始采集PBSC。

1.3.2 单采仪器的选择 对于体重 >30 kg,红细胞压积(HCT)>24%的小儿,可选用3种分离机中的任何一种进行采集(全血流速为10~50 ml/min);对于体重﹤ 30 kg、HCT >24%或者体循环(TBV)>1650 ml的小儿,可选用CS-3000 Plus(小体积分离槽和小体积收集槽)或COBE Spectra血细胞分离机低流速分离(全血流速为10~30 ml/min);对于体重<20 kg,HCT﹤24%或者TBV≤1100~1650 ml的小儿,先用经过25 Gy γ射线照射的同型少白细胞红细胞1 U充盈分离管路,再选用3种分离机中的任何一种血细胞分离机低流速分离。

1.3.3 PBSC采集 对于体重﹤30 kg的小儿,使用小体积分离槽和小体积收集槽,选择儿童外周血单个核细胞(MNC)收集程序(预设Specil8程序),全血流速为10~30 ml/min。对于体重﹤20 kg小儿,HCT﹤24%时,初始化后用经过25 Gy γ射线照射的同型少白细胞红细胞1 U充盈分离管路[10]。根据小儿 HCT、MNC计数修改地址68和71的内容,设定循环血量为2~3倍TBV。采集在第一次溢出结束时设定界面探测值基线(IDB),收集终产品约50 ml。

1.3.4 使用6.1版本软件的 COBE Spectra血细胞分离机和双级充填盘 按照采集液流径指示膜安装AutoPBSC管路,初始化后输入患儿的身高、体重、HCT、WBC 计数、MNC%,设定循环血量为患儿TBV的2~3倍,全血流速10~45 ml/min。采集PBSC的收获量3~5 ml,追赶量为3~7 ml,设定合适的收获次数,产品终体积为(收获量+追赶量)×收获次数。如果系统的体外环路容量超过患儿TBV的10%~15%或者患儿TBV≤1100~1650 ml,需要增加血液预注,方法同前。本方法采集的18例中,有2例体重分别为17 kg、18 kg,采用了血液预注和低流速分离,维持了患儿分离过程的血液动力学稳定。

1.3.5 使用COM TEC血细胞分离机 选择autoMNC(P1YA)程序和配套分离盘,安装P1YA耗材并初始化,输入患儿各项参数(包括采集前CD34+细胞计数),初始时白膜泵出菜单(每循环全血量、白膜泵出量、白膜收集量、循环次数)和过程参数菜单(血流量、抗凝剂比例、离心机转速)均显示机器自动设置值和默认值,采集过程中观察离心腔内白膜形成情况,在第3个循环开始时再根据白膜厚度(2 mm较为适宜)和质地调节每循环全血量,在分离过程中每处理3000 ml全血再增加20 ml,白膜泵出量自体15 ml、异体25 ml,白膜收集量自体4~7 ml、异体 7 ~10 ml,全血流速 10 ~50 ml/min,当HCT﹤24%时,全血流速要控制在40 ml/min以内。体重﹤30 kg时,在采集开始阶段,先用红细胞充管路(方法同前),速度从10 ml/min开始,最高不超过30 ml/min。本方法采集3例,其中2例异体健康供者,体重>30 kg,均一次采集成功。

1.3.6 抗凝剂 ACD-A与全血比例 儿童对ACD-A较为敏感,较易发生枸橼酸盐中毒,在分离过程中ACD-A与全血比例应控制在1∶10~1∶13,采集过程中密切观察儿童有无口周及四肢麻木、恶心、抽搐等枸橼酸盐中毒表现,如有发生要及时处理。采集前和采集中给予10%葡萄糖酸钙10 ml口服,预防低钙血症发生。

1.3.7 检测指标 自动员起至采集结束,每天检测供者外周血血常规和MNC。应用流式细胞仪(美国BD公司)检测动员前后及采集产品CD34+数。

1.4 统计学处理 采用SPSS 11.0统计学软件,计量资料以表示,相关性分析采用线性回归,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动员与采集效果 使用CS-3000 Plus血细胞分离机普通分离槽和小体积收集槽采集8例,使用小体积分离槽和小体积收集槽采集2例;6.1版本软件的COBE Spectra血细胞分离机采集18例;COM TEC血细胞分离机采集3例。本组31例均采集成功,采集次数1~5次,平均1.5 次,获得 CD34+细胞数(7.9 ±2.9)×106/kg,MNC(7.4 ±3.1)×108/kg(表 1)。在采集过程中供者和患者均未出现麻木、呕吐等并发症。

2.2 CD34+细胞数和采集循环血量及MNC的相关性 31例PBSC采集产品中收获的CD34+数量和MNC数、循环血量呈正相关(图1、2)。

3 讨论

3.1 儿童外周血造血干细胞采集的有效性

异体和自体PBSC能恢复衰竭的骨髓造血功能,已成为干细胞移植的主要来源。然而,能否成功采集到足够数量的外周血干细胞是移植成功的前提和关键。文献报道,儿童PBSCT所需CD34+数最低为 2.0 ×106/kg,理想目标是 5.0×106/kg[7]。从本组 31 例儿童患者/供者采集结果看,经G-CSF动员后,于d 5用血细胞分离机采集 PBSC,采集物中 CD34+细胞数达到(7.9 ±2.9)×106/kg,MNC 为(7.4 ±3.1)×108/kg,能满足 PBSCT所需求的 CD34+细胞数/kg 体重(2.0 ~5.0)×106[8-9]。Richard 等报道,儿童患者平均输入6.0×106/kg的CD34+细胞,其中性粒细胞恢复时间与CD34+细胞数无相关性,但血小板恢复到 50000/mm3在CD34+细胞 <4.0×106/kg和 >4.0×106/kg

组之间有差别。本组儿童最低CD34+细胞数为4.2×106/kg,临床移植均获得成功,说明我们的采集方法和程序是十分有效的。

表1 外周血干细胞动员与采集效果Table 1 Mobilization and collection efficiency of PBSCs

图1 CD34+细胞数与患者/供者采前MNC数的关系Fig.1 Relationship between CD34+cell count per component and MNCs before apheresis

图2 CD34+细胞数与循环血量的关系Fig.2 Relationship between CD34+cell count per component and processed volume

3.2 儿童外周血造血干细胞采集的影响因素本研究结果显示:①采集物中CD34+与患者/供者采前MNC计数呈正相关,提示采前外周血中相对高的MNC可获得较多的CD34+细胞。本组 31例经 G-CSF动员后,d 5采集PBSC,平均采集1.5次;其中20例1次采集即可获得移植所需求的CD34+细胞,表明我们的动员方案是合适的。②采集效果与采集的循环血量呈正相关,考虑到采集时体外血量大于全身血量(75 ml/kg)的10% ~15%,容易出现低血容量综合征[10];同时,回输氯化钠溶液会使体内HCT发生变化,影响 PBSC的采集效果。为此,体重<20 kg的患儿,在初始化完成后再给予辐照同型的少白细胞、红细胞悬液的预先充盈管路,使患儿体内血液容量保持稳定;这样能够保证儿童PBSC采集时的采集循环血量。③儿童对抗凝剂较为敏感,如采集过程中血钙偏低,较易发生枸橼酸钠中毒,主要表现为口角麻木、心慌、气短、眩晕、呕吐、呼吸困难及穿刺处血肿、感染等。本组通过缓解供者紧张心理,将抗凝剂与全血比例维持在1∶10~1∶13之间,减少枸橼酸钠的输入量,采集前常规口服葡萄糖酸钙,采集中视供者状况口服葡萄糖酸钙,均未出现枸橼酸中毒及其他不良反应。

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