右美托咪定预处理减轻离体大鼠心脏缺血/再灌注损伤的线粒体相关机制

姜翠翠，夏满莉，王 敏，陈士票

(嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001）

缺血性心肌梗死是当今人类的主要致死原因之一，及早恢复缺血区心肌的血流供应是减少心肌细胞死亡，挽救患者生命的最佳办法;但是，恢复血流灌注后又给心肌带来了心律失常、心肌梗死等新的损伤，即缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤［1］。心肌 I/R损伤机制复杂，有研究发现电刺激迷走神经可减少心肌I/R引起的心肌损伤，其机制可能与抑制线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)开放有关［2］;研究认为，增强迷走神经兴奋可能是减少I/R损伤，挽救缺血心肌的有效辅助治疗手段。

右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)为高选择性α2-肾上腺素能受体激动剂，可抑制交感神经兴奋性，增强迷走神经兴奋性，常用于血管疾病患者围手术期的辅助麻醉与镇静镇痛，有助于减少围手术期的心脏副反应［3］。研究发现，通过Dex预处理，可激活α2-肾上腺素能受体，减轻大鼠心肌I/R损伤［4-5］。再者，线粒体是缺血药物预处理发挥心肌保护作用的终末效应器之一［2，6］，Dex 减少心肌 I/R 损伤亦可能与调控心肌mPTP开放及其上游线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrialATP-sensitive potassium channel，mitoKATP)活性有关［2，4］，但有关Dex的心肌线粒体作用国内外尚未见报道。本实验应用Langendorff模型研究Dex对离体大鼠心脏I/R时心功能及心肌梗死的影响，探讨Dex预处理与心肌mitoKATP-mPTP的关系。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 苍术苷(atractyloside，Atr)、5-羟基癸酸(5-hydroxydecanoate，5-HD)及氯化三苯四氮唑(2，3，5-triphenylterazolium chloride，TTC)均购自 Sigma公司。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)购自江苏恒瑞医药股份有限公司，批号为20100412，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)测试盒购自南京建成生物工程研究所，其余试剂为市售分析纯。Krebs-Henseleit(K-H)液(mmol/L):NaCl 118.0、KCl 4.7、KH2PO41.2、MgSO41.2、NaHCO325.0、葡萄糖 10.0、CaCl22.5，pH 7.4，以95%O2+5%CO2饱和。

1.2 离体心脏Langendorff灌流和左心室功能评价 雄性SD大鼠(体重240～270 g，由浙江省医学科学院实验动物中心提供)断头后开胸迅速取出心脏，置于4℃改良K-H液中洗净血液，转移并固定于Langendorff灌流装置，以改良K-H液行常规恒压(76 mmHg)灌流，维持灌流液温度(37℃)。切开左心耳，将充水乳胶囊由此插入至左心室，囊内压力经特氟纶管传递至压力传感器，由Medlab生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司)记录和分析。向插入左心室内的乳胶囊注水使左心室舒张末压(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)维持于5～8 mmHg，连续记录实验过程中左心室发展压(left ventricular developed pressure，LVDP)及心率(heart rate，HR)等各项指标［7］。

1.3 心肌I/R损伤模型制备 采用全心停灌的方法制备I/R损伤模型，即心脏在Langendorff灌流装置平衡20 min，继续灌流20 min后，停止灌流30 min作为缺血，再灌注120 min。

1.4 冠脉流出液LDH活性的测定 在复灌5 min末收集冠脉流出液，按试剂盒说明检测LDH活性。

1.5 心肌组织活性的测定 心脏从灌流装置上取下后切成1～2 mm薄片，在37℃水浴中用TTC(1%)孵育30 min后，取出心肌片，吸干表面的水分并称其湿重，加入二甲基亚砜(20 ml/g)后匀浆，离心(1000×g，10 min)，取上清液在490 nm处测量其吸光度，以吸光度值大小反映心肌组织活性。

1.6 实验分组 大鼠随机分为5组(n=9):①正常对照组(Con):离体心脏Langendorff灌流190 min;②I/R损伤组(I/R):离体心脏平衡20 min，继续灌流20 min，全心停灌30 min作为缺血，然后再灌注120 min;③Dex预处理组(Dex):同I/R组，但在停灌前15 min用含Dex(10 nmol/L)的K-H液灌流，停灌30 min后用KH 液再灌注 120 min［4］;④Dex+5-HD 组:平衡20 min后用含5-HD(100 μmol/L)的K-H液灌流20 min，再灌注前15 min加入Dex(10 nmol/L)，停灌30 min后用K-H液再灌注120 min;⑤Dex+Atr组:同Dex预处理组，但于再灌注前20 min用含Atr(20 μmol/L)的K-H液灌流。

2 结果

2.1 Dex预处理对I/R心脏冠脉流量及左心室收缩功能的影响 表1示，各组别大鼠的基础冠脉流量、LVDP及LVEDP差异无显著性;与正常对照组比较，I/R组再灌注期的冠脉流量和LVDP均明显下降(P＜0.01)，而LVEDP显著增加(P＜0.01);Dex(10 nmol/L)预处理15 min均明显减弱I/R对冠脉流量及LVDP的抑制作用(P＜0.01)以及对LVEDP的抬升作用(P＜0.01)，Dex预处理对再灌注期间心功能的改善作用均被5-HD及Atr所逆转(P＜0.01)。在整个实验过程中，各组间心率无明显变化(数据略)。

表1 Dex预处理对I/R心脏冠脉流量及左心室收缩舒张功能的影响Table 1 Effect of dexmedetomidine(Dex)preconditioning on coronary flow and left ventricular systolic and diastolic function in isolated rat hearts subjected to ischemia/reperfusion(n=9，)

表1 Dex预处理对I/R心脏冠脉流量及左心室收缩舒张功能的影响Table 1 Effect of dexmedetomidine(Dex)preconditioning on coronary flow and left ventricular systolic and diastolic function in isolated rat hearts subjected to ischemia/reperfusion(n=9，)

与正常对照组(Con)比，＊＊P ＜0.01;与缺血/再灌注损伤组(I/R)比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与 Dex预处理组(Dex)比，+P ＜0.05，++P ＜0.01.

2.2 Dex预处理对I/R心脏心肌活性及冠脉流出液LDH含量的影响 图1示，与正常对照组比较，I/R组再灌注结束后心肌组织活性标记物 formazan含量明显下降(P＜0.01)，Dex(10 nmol/L)预处理15 min明显减弱了I/R对心肌组织活性的损伤作用(P＜0.01)，该改善作用被5-HD及Atr所逆转(P＜0.01)。由图2所见，Dex预处理明显抑制了I/R导致的冠脉流出液LDH含量增加(P＜0.01)，而5-HD及Atr处理则取消了Dex减少冠脉流出液LDH含量的作用。

图1 Dex预处理对I/R心脏formazan含量的影响Fig.1 Effect of dexmedetomidine，5-hydroxydecanoate and atractyloside on the formazan content from the isolated rat hearts subjected to I/R

3 讨论

本实验在离体大鼠全心I/R模型上发现，Dex预处理明显增加了I/R大鼠心脏冠脉流量，减少了心肌损伤标志酶LDH的漏出及心肌组织活性的下降，改善了再灌注左心室收缩与舒张功能，这些心功能改善作用均被mitoKATP阻断剂5-HD及mPTP开放剂Atr所逆转，提示Dex预处理具有对抗心肌I/R损伤作用，且该作用与mitoKATP的激活及下游mPTP开放受阻有关。

图2 Dex预处理对I/R心脏冠脉流出液LDH的影响Fig.2 Effect of dexmedetomidine on the LDH activity in the coronary effluent from the isolated rat hearts subjected to I/R

在心血管系统中，Dex作为高选择性α2-肾上腺素能受体激动剂具有多种生物学效应，如通过不同亚型的α2-肾上腺素能受体产生舒张或收缩血管效应［8］，增强迷走神经兴奋性使心肌耗氧降低，防止缺血心肌因能量耗竭而梗死［3，5］。由于 Dex 具有良好的心血管保护作用，其越来越多地应用于围手术期的辅助麻醉［9］，但是有关Dex对I/R心肌损伤作用的研究却不多见，且基本上停留在α2-肾上腺素能受体激动剂的研究水平，其下游所涉及的机制并不清楚。研究发现，Dex的心肌保护作用在临床镇静用药时达到的最小与最大血浆浓度(0.23 ～2.3 ng/ml，对应1 ～10 nmol/L)范围内是浓度依赖性增强的［4］，故本实验选择近似于临床Dex用药浓度的上限值，以期产生探讨Dex心肌保护作用的线粒体相关机制。

心肌I/R损伤涉及的机制复杂，其中再灌注期的活性氧自由基大爆发、心肌细胞内Ca2+超载等因素促使mPTP开放，线粒体膜电位崩解，释放细胞色素C等诸多凋亡诱导因子至细胞质诱发细胞凋亡，这是公认的心肌I/R损伤的经典途径［7］。本研究是在离体心脏上进行的，排除了迷走神经兴奋在Dex预处理心肌保护作用中的影响，Dex改善了再灌注离体心脏的冠脉流量及左心室泵血功能，这可能是因为Dex通过激活冠状动脉的α2-肾上腺素能受体，促使血管短暂收缩，产生了类似于缺血预处理的作用［4］;且Dex亦有可能通过激活心肌细胞的α-肾上腺素能受体，产生正性肌力作用，提高I/R心脏左心室泵血功能，由此冠脉循环增加，增加心肌氧及营养物质供应，形成心功能改善的良性循环。Dex的心功能改善作用被mPTP开放剂Atr所取消，提示Dex预处理可能抑制了心肌mPTP在再灌注期间的开放，维持了线粒体膜结构的完整性，减少了线粒体依赖性细胞凋亡［2，8］。Dex预处理组心肌组织活性增加及冠脉流出液LDH含量减少，进一步说明Dex预处理明显减少了I/R诱导的心肌细胞膜破裂及线粒体功能紊乱。

缺血前mitoKATP开放是抵抗心肌I/R损伤的一条重要通路，mitoKATP开放后可能通过激活再灌注期蛋白激酶C-ε、磷脂酰肌醇-3-激酶或腺苷A2b受体，共同促进线粒体糖原合成酶激酶-3β磷酸化，并抑制线粒体基质亲环蛋白D与内膜腺嘌呤核苷酸移位酶的结合(这两者是构成mPTP的主要成分)，由此减少线粒体依赖的心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用［10］。本实验中Dex预处理所产生的心肌保护作用被mitoKATP阻断剂5-HD所取消，提示Dex预处理可能在心肌缺血前激活了mitoKATP，启动了再灌注期心肌保护的线粒体通路。有研究显示mitoKATP开放后，减少了心肌线粒体Ca2+超载以及由此带来的氧化应激，从而抑制mPTP开放并维持线粒体膜结构的稳定［7］。缺血前5-HD处理及再灌注早期添加Atr均取消了Dex预处理的心肌保护作用，进一步提示缺血前mitoKATP激活以及由此引发的再灌注期mPTP开放受阻，这可能是Dex预处理发挥心肌保护作用的一条重要的线粒体通路。

综上所述，尽管缺血预处理的心肌保护作用是公认的，但是由于其操作上的难度在临床应用上并不可行。本研究发现Dex作为一种围手术期常用的辅助麻醉与镇静镇痛药，具有减少心肌I/R损伤作用，且该心肌保护作用可能与Dex促进心肌缺血前mitoKATP的开放，抑制再灌注早期mPTP的开放有关。这一发现为心血管手术中预处理心肌保护药物的选择提供了新思路，Dex在作为麻醉药的同时，亦可能是一种有效且易于实施的抗心肌I/R损伤的预处理药物。

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