石油污染地下水中苯降解菌的代谢特征

金欢驰, 张玉玲, 党江艳

(吉林大学 环境与资源学院, 水资源与环境研究所, 长春 130012)

微生物修复是一种低能耗处理石油污染地下水的有效方法[1]. 但土著微生物生长缓慢, 且数量有限, 使生物修复过程受限. 通过人工富集降解石油类土著微生物, 发挥其最大效能, 是提高石油污染地下水生物修复效率的主要方法[2]. 苯是石油污染组分中的常见物质, 由于其化学结构及易迁移的特点, 在自然环境中不易降解. 目前, 苯降解菌的研究主要为苯降解菌菌株的筛选鉴定、 降解影响因素、 降解酶的基因组学以及理论微生物降解途径[3-5]等. Caldwell等[6]通过检测苯降解过程的中间产物, 提出了苯转化为苯甲酸的厌氧生物降解途径； 文献[7-8]分别采用高效液相色谱(HPLC)和红外分析检测苯降解的中间产物, 推测了苯的生物降解途径及化学催化氧化途径. 本文在采集样品并分离出苯降解菌的基础上, 模拟低温地下水环境条件, 研究降解菌的代谢机制, 并推测苯降解菌在低温环境中的代谢特征.

1 实 验

1.1 仪器和试剂

HZQ-QX型全温振荡器(上海博讯实业有限公司)； RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)； OI4560型吹扫捕集仪(美国OI公司); Agilent 6890/5973 GC-MS型气质联用仪(美国安捷伦公司)； CH2O型电子显微镜(德国OLYMPUS公司). 所用主要化学试剂均为国产分析纯, 苯标准品购自国家标准物质中心.

液体培养基： NH4NO32 g, K2HPO41.5 g, KH2PO43 g, MgSO4·7H2O 0.1 g, 无水CaCl20.01 g, Na2EDTA·2H2O 0.01 g, 苯 1 mL, 蒸馏水 1 L. 固体培养基在液体培养基的基础上加入10 g琼脂.

1.2 实验方法

1.2.1 菌种来源 菌种来源于东北某油田区石油类污染浅层地下水, 主要特征污染物为苯[9].

1.2.2 苯降解菌的富集纯化 将1 mL石油污染地下水置于液体培养基中, 密封, 于10 ℃,100 r/min培养至液体变浑浊, 每隔3～4 d将0.5 mL菌悬液转移至150 mL液体培养基中, 共转移5次； 采用稀释涂布法, 先将富集后的培养液均匀涂布于固体培养基上, 再将浸有苯液的棉花置于培养皿盖一侧, 密闭倒置培养皿, 10 ℃培养2 d后挑选单菌落, 画线分离, 得到6株以苯为唯一碳源和能源的菌株B1～B6.

1.2.3 石油污染地下水微环境模拟实验 挑取单菌落置于装有150 mL石油污染地下水(400 mg/L苯)的密闭玻璃瓶中, 空白溶液作为对照, 每组做3个平行样. 在10 ℃,100 r/min的振荡培养箱中放置3 d, 取1 mL上清液, 稀释1 000倍后利用吹扫捕集-气质联仪测试苯的质量浓度, 确定苯的优势降解菌.

1.2.4 优势菌种降解苯的代谢产物检测

1) 优势苯降解菌生长曲线的绘制及儿茶酚双加氧酶的活性检测： 将0.5 mL菌悬液置于液体培养基中, 在10 ℃,100 r/min条件下培养, 每组做3个平行样, 采用分光光度法测试微生物的OD660值, 绘制生长曲线, 并参照文献[10-11]方法测试儿茶酚1,2-双加氧酶和儿茶酚2,3-双加氧酶的活性.

2) 双加氧酶的检测： 将0.002 0 g儿茶酚溶于蒸馏水中, 取2滴置于0.5 mL的发酵液中, 密封, 观察儿茶酚溶液颜色和发酵液溶液颜色的变化.

3) 代谢产物检测： 采用微环境降解实验溶液, 通过两种方式检测降解代谢产物.

① 利用吹扫捕集仪和气质联用仪对样品进行全扫描和测试, 并分析质谱中苯降解后的分子碎片峰;

② 将10 mL发酵液和3 mL二氯甲烷置于50 mL分液漏斗中, 振摇3 min, 取上层有机相过无水硫酸钠, 经旋转蒸发仪将萃取液浓缩至1 mL, 用气质联用仪全扫描分析.

仪器测定条件参见文献[12].

1.2.5 优势菌种的生理生化特性检测 根据菌种特性, 主要进行三糖铁实验、 葡萄糖发酵实验、 甲基红实验、 吲哚实验、 产氨实验、 柠檬酸盐利用实验、 油脂水解实验、 淀粉水解实验、 明胶液化实验、 V.P实验、 3-酮基乳糖测定实验、 纤维素水解实验、 产硫化氢实验、 氧化酶实验、 接触酶实验、 硝酸盐还原实验、 亚硝酸盐还原和反硝化实验.

1.2.6 菌种鉴定

1) 菌株显微镜下形态表征： 采用革兰氏染色实验鉴定菌种.

2) 菌种基因鉴定： 采用荧光定量PCR仪进行16S rDNA扩增, 在上海生物工程有限公司测序.

2 结果与讨论

2.1 菌种的筛选结果与分析

实验采用废弃井返水事故产生的含水层地下水(主要为Ca-Na-HCO3-Cl型水), 水样中总石油烃(TPH)的质量浓度为36 mg/L[9]. 本文模拟地下水中的微生物处于寡营养状态, 使其生长环境与浅层地下水环境接近. 苯的初始质量浓度为394.36 mg/L, 6种菌在微环境中生长繁殖后, 在第3天取样测试, 水相体系中苯的质量浓度测试结果如图1所示. 由图1可见, 6种菌均有降解苯的能力, 其中B6菌降解效果最好, 降解率为82.82%. 因此以B6菌为考察对象进行代谢特征研究.

2.2 B6菌降解苯过程中代谢物质分析

2.2.1 儿茶酚降解酶的活性检测 B6菌的生长曲线及儿茶酚降解酶的活性测定结果如图2所示. 由图2可见, 在B6菌的生长期内, 儿茶酚2,3-双加氧酶的活性基本为零, 表明在该实验条件下, 儿茶酚2,3-双加氧酶基本未参与苯的生物降解. 儿茶酚1,2-双加氧酶的活性在该过程中逐渐升高, 3 d后逐渐下降, 与B6菌的生长曲线一致. 因此, 在B6菌降解苯过程中, 产生了儿茶酚1,2-双加氧酶.

图1 6种降解菌对苯的降解效果Fig.1 Biodegradation of benzene by six isolated-strains

图2 B6菌的生长曲线及儿茶酚降解酶的活性测定Fig.2 Growth curves of B6 and the enzyme activity of catechol dioxygenase

2.2.2 双加氧酶的检测分析 所有芳香族化合物均先降解为儿茶酚, 在双加氧酶的作用下, 儿茶酚发生裂解, 使苯环断裂[10,13]. 实验中发现经过较短时间发酵液变为黄色, 表明儿茶酚已被双加氧酶氧化, 从而证实苯系物降解途径包括儿茶酚降解.

图3 采用二氯甲烷萃取后B6菌全扫描色谱Fig.3 Full-scan spectrum of B6 strain extracted by methylene chloride

2.2.3 菌种代谢物的检测分析 采用吹扫捕集-GC/MS直接吹扫、 二氯甲烷萃取液和正己烷萃取液定性检测方法, 分析B6菌代谢产物, 在直接吹扫和正己烷萃取液定性检测谱中未发现代谢中间产物的衍生物质, 而在经二氯甲烷萃取的溶液中发现了代谢中间产物的衍生物质, 测试结果如图3所示. 由图3可见, 在全扫描色谱中未出现甲苯和二甲苯等苯系物的谱峰, 表明B6菌将苯和其他苯系物均降解了. 在经二氯甲烷萃取后, 出现较多B6降解菌的中间代谢产物衍生物质, 如在保留时间19.73 min, 出现邻苯二甲酸酯类物质, 在保留时间17.91 min, 出现内酯开环后生成的丁二酸酯类物质. 因此可推测B6菌生物降解苯的途径如图4所示, 主要按儿茶酚正位裂解途径进行.

图4 苯降解途径Fig.4 Degradation approach of benzene

2.3 优势菌种的生理生化特性检测

B6菌的生理生化实验结果列于表1. 由表1可见: B6菌在代谢过程中产生色氨酸酶、 脂肪酶、 淀粉酶、 明胶酶、 乳糖酶和氧化酶等, 葡萄糖、 乳糖、 蛋白质、 色氨酸、 脂肪、 淀粉、 明胶、 多肽、 纤维素、 含硫有机物、 细胞色素C、 硝酸盐及亚硝酸盐为其营养物质； 亚硝酸盐为B6菌代谢的电子受体； 硝酸盐为B6菌代谢的终末受氢体或电子受体.

表1 B6菌的生理生化实验*

* “+”表示反应为阳性; “-”表示反应为阴性.

2.4 菌种鉴定结果

B6菌在显微镜下的形态如图5所示. 由图5可见, B6菌菌落形态为圆形不透明, 质地粗糙, 淡黄色. 根据革兰氏染色和基因鉴定结果可知, B6菌为革兰氏阳性红平红球菌, 其系统发育树如图6所示.

图5 B6菌在显微镜下的形态Fig.5 Morphology of B6 strain

图6 B6菌系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of B6 strain

由图6可见, B6菌与RhodococcuserythropolisPR4的同源性最高, 该菌可利用C8～C20的烷烃为唯一碳源和能源, 其代谢底物具有多样性, 尤其对疏水化合物的代谢(如烃类、 煤和石油)[14].

综上所述, 本文从石油污染的地下水样品中富集、 纯化和筛选得到一株红平红球菌B6, 该菌对苯具有较好的降解性能, 当苯的初始质量浓度为394.36 mg/L时, B6菌对苯的降解率为82.82%. B6菌在代谢过程中产生多种酶类物质, 利用葡萄糖、 乳糖和含硫有机物等作为营养物质, 亚硝酸盐和硝酸盐为其代谢电子受体. 通过检测酶活及菌种代谢的中间产物可知, B6菌在实验条件下对苯的生物降解途径为儿茶酚正位裂解.

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