三七三醇皂苷对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的保护作用*

朱德淼 刘学政

糖尿病可诱导视网膜神经节细胞（retinal gangli⁃on cell，RGC）凋亡，引发糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR），是成年人视力减退甚至失明的重要原因之一[1]。三七三醇皂苷（Panax notoginseng，PTS）是中药三七的重要活性成分，可改善脑缺血所致的脑体积缩小及神经功能缺损，有明显的神经保护作用[2-3]。本研究拟探讨PTS对糖尿病大鼠视网膜RGC的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 30只SD大鼠雌雄不限，体质量200～230 g，购自辽宁医学院实验动物中心；PTS购自成都华神集团股份有限公司制药厂；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、羊抗大鼠Nogo受体一抗、小鼠抗大鼠Brn3a一抗、A594-驴抗羊二抗及A488-驴抗小鼠二抗均购自美国Sigma公司；MDA试剂盒购自北京碧云天生物公司。

1.2 糖尿病模型的建立及实验分组 动物随机分为对照组、糖尿病组和治疗组，每组10只。糖尿病组和治疗组腹腔注射1%STZ溶液（60 mg/kg），48 h后尾静脉取血测血糖，若大于16.7 mmol/L即为模型建立成功。治疗组给予PTS 50 mg·kg-1·d-1灌胃给药，每日2次。对照组及糖尿病组给予等剂量生理盐水。1个月后进行指标检测。

1.3 Nogo受体及Brn3a荧光免疫组化双标 快速摘除大鼠双侧眼球，于解剖显微镜下，以眼科剪沿角膜缘剪开眼球，去除角膜、晶状体及玻璃体，剥离视网膜，滤纸吸干后称质量。常规制备视网膜石蜡切片，脱蜡至水化。以羊抗大鼠Nogo受体/小鼠抗大鼠Brn3a一抗混合液于4℃孵育48 h，均稀释为1∶200（Brn3a为RGC特异性标志物），再以A594-驴抗羊/A488-驴抗小鼠二抗混合液孵育室温4 h（均稀释为1∶500），封片，荧光显微镜下观察。

1.4 Western blot检测Nogo受体表达 将视网膜以4℃生理盐水制备1%浓度组织匀浆。蛋白裂解液裂解后以12 000 r/min离心15 min，上清液以80 V电压聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法移至PVDF膜，以Nogo受体及β-actin一抗于37℃分别孵育2 h，再以辣根过氧化物酶标记的二抗室温分别孵育1 h，试剂盒显影。Nogo与β-actin条带光密度值之比即为Nogo受体相对表达量。

1.5 视网膜丙二醛（MDA）含量检测 以4℃生理盐水制备5%的视网膜匀浆，4 000 r/min离心10 min后取上清，按试剂盒提供的操作步骤及公式，利用硫代巴比妥酸法检测视网膜中MDA含量。

1.6 视网膜HE染色 常规制备视网膜石蜡切片，脱蜡入水，经苏木精染色、分色、水洗、乙醇伊红染色液染色、乙醇逐级脱水及二甲苯透明等常规步骤，封片后镜下观察，每个视网膜随机读取3个视野，计数3次，取平均值，计算各组RGC密度。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0软件对实验结果进行统计学处理，数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖水平 造模48 h后，糖尿病组及PTS治疗组血糖明显高于对照组（均P＜0.001），糖尿病模型构建成功，见表1。

Table 1 Comparison of blood glucose，expression of Nogo receptor,the level of MDA,and density of RGC between three groups表1 3组大鼠血糖、视网膜Nogo受体表达、MDA含量及RGC密度比较 （n=10，x±s）

2.2 Brn3a和Nogo受体表达情况 荧光免疫组化双标显示，Brn3a与Nogo受体于视网膜内大量共存，见图1。

2.3 PTS对糖尿病大鼠视网膜Nogo受体表达的影响 糖尿病组Nogo受体表达水平明显高于对照组和治疗组，差异有统计学意义（P＜0.001），见表1、图2。

Figure 2 Expression levels of retinal Nogo receptor in three groups图2 各组视网膜Nogo受体表达

2.4 PTS对糖尿病大鼠视网膜MDA含量的影响 3组间MDA含量差异有统计学意义（P＜0.01），糖尿病组高于对照组和治疗组（均P＜0.001），见表1。

2.5 PTS对糖尿病大鼠RGC密度的影响 糖尿病组视网膜神经节细胞层RGC密度较对照组和治疗组明显减少（P＜0.001），见表1、图3。

3 讨论

糖尿病累及视网膜即发生DR，视网膜RGC受损是DR患者视力减退的重要原因[4]。糖尿病患者DR发病率高，即使严格控制血糖也不能完全防治DR，患者仍有视力减退甚至失明的危险。糖尿病病程5年患者DR发病率约为44.4%，7年约为56%左右，10年约60%，15年则高达80%[5-6]。预计2030年全球糖尿病患者将达3亿6千万[7]，DR已经成为成年人致盲的重要因素[8]。

三七是一种传统中药，PTS是三七的重要活性成分之一。本研究发现，糖尿病大鼠视网膜RGC数量明显减少，给予PTS可恢复糖尿病大鼠视网膜RGC数量，表现出了明显的神经保护作用。

PTS保护缺血脑神经元的机制尚不完全清楚，可能与PTS抑制神经元Nogo受体及其配体Nogo-A的表达，促进脑缺血后的神经再生有关[2-3]。Nogo受体是一种髓磷脂相关蛋白，可抑制神经再生，在视网膜仅表达于RGC细胞内[9]。本研究也发现，Nogo受体与Brn3a在视网膜内大量共存，仅表达于视网膜RGC内。青光眼时视网膜RGC细胞Nogo受体表达增加，抑制Nogo受体表达可抑制RGC细胞凋亡，Nogo受体表达增加是视网膜RGC凋亡的重要机制之一[10]。本研究结果显示，PTS恢复糖尿病大鼠视网膜RGC数量的同时，视网膜Nogo受体表达减少，提示下调Nogo受体表达可能是PTS保护糖尿病视网膜RGC的重要机制之一。

Nogo受体抑制细胞凋亡的机制复杂，可影响线粒体膜电位，是细胞氧自由基堆积，导致凋亡的重要因素之一[11]。因此，Nogo受体可能通过氧自由基堆积诱导RGC细胞凋亡。高血糖可诱发氧化应激，MDA水平是氧化应激的重要指标之一。本研究表明，糖尿病时视网膜MDA水平增高，说明糖尿病视网膜氧化应激明显。PTS下调糖尿病大鼠视网膜Nogo受体表达的同时，伴有视网膜MDA含量的降低，表明PTS下调糖尿病大鼠视网膜Nogo受体表达的同时可降低视网膜氧化应激水平。因此，PTS可能通过下调RGC内Nogo受体的表达，抑制RGC氧化应激反应，从而对糖尿病视网膜RGC发挥保护作用。

本研究证实了PTS对糖尿病大鼠视网膜RGC的保护作用，并研究了作用机制，为DR的临床治疗提供了思路，但DR发病机制复杂，PTS在DR防护中的作用仍需深入探讨。

Figure 1 Colocalization of Brn3a and Nogo receptor in retina(immunofluorescence histochemical double-staining×200)图1 Brn3a与Nogo受体在视网膜内的共存（荧光免疫组化双标,×200）

Figure 3 Photos showing the number of RGC in three groups of diabetic rats(HE staining，×200)图3 3组糖尿病大鼠RGC密度（HE染色，×200）

[1]Ola MS,Nawaz MI,Khan HA,et al.Neurodegeneration and neuro⁃protection in diabetic retinopathy[J].Int J Mol Sci,2013,14(2):2559-2572.

[2]朱陵群,王席玲,邹忆怀,等.三七三醇皂苷对MCAO大鼠不同恢复时点Nogo-A和其受体NgR mRNA表达的影响[A].中华中医药学会脑病分会成立大会暨2008年全国中医脑病学术研讨会论文汇编,2008,181-185.

[3]翟建英,崔方圆,邹蔚萌,等.三七三醇皂苷对脑梗死后不同时点Nogo-A表达的影响[J].中国中药杂志,2008,33(4):470-473.

[4]Dong LY,Jin J,Lu G,et al.Astaxanthin Attenuates the Apoptosis of Retinal Ganglion Cells in db/db Mice by Inhibition of Oxidative Stress[J].Mar Drugs,2013,11(3):960-974.

[5]Malone JI,Morrison AD,Pavan PR,et al.Prevalence and signifi⁃cance of retinopathy in subjects with type 1 diabetes of less than 5 years'duration screened for the diabetes control and complications trial[J].Diabetes Care,2001,24(3):522-526.

[6]Nakajima M,Cooney MJ,Tu AH,et al.Normalization of retinal vas⁃cular permeability in experimental diabetes with genistein[J].In⁃vest Ophthalmol Vis Sci,2001,42(9):2110-2114.

[7]Wild S,Roglic G,Green A,et al.Global prevalence of diabetes:es⁃timates for the year 2000 and projections for 2030[J].Diabetes Care,2004,27(5):1047-1053.

[8]Silva PS,Cavallerano JD,Sun JK,et al.Effect of systemic medica⁃tions on onset and progression of diabetic retinopathy[J].Nat Rev Endocrinol,2011,6(9):494-508.

[9]Yin X,Chen C,Yuan R,et al.An immun of luorescence-histochemis⁃try study of the Nogo receptor in the rat retina during postnatal de⁃velopment[J].Ann Ophthalmol(Skokie),2007,39(2):140-144.

[10]Fu QL,Liao XX,Li X,et al.Soluble Nogo-66 receptor prevents syn⁃aptic dysfunction and rescues retinal ganglion cell loss in chronic glaucoma[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2011,52(11):8374-8380.

[11]Al-Shabrawey M,Smith S.Prediction of diabetic retinopathy:role of oxidative stress and relevance of apoptotic biomarkers[J].EPMA J,2010,1(1):56-72.