PIK3CA在胃癌病变中表达的研究*

马菲菲 张庆瑜 王 涛 康春生 徐 蓉 蔡凤英 宋小妹

磷脂酰肌醇3－激酶催化亚基α（PIK3CA）基因位于3号染色体长臂26号位点3区，全长34 kb，编码IA型磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）的p110α催化亚基，即PI3Kp110α蛋白。目前普遍认为PIK3CA的突变在肺癌[1]、脑癌、乳腺癌、结肠癌[2]等多种实体肿瘤发生发展中具有重要作用。但有研究证实，PIK3CA基因突变在胃癌发生发展过程中的作用不明显[3]，胃癌中PIK3CA表达是否增强，与肿瘤病理分型存在何种关系，在PI3K/Akt信号通路中起到何种作用尚不清楚[4]。本研究采用组织芯片和免疫组织化学技术，检测和分析了不同病理级别胃腺癌、癌旁组织和正常胃黏膜中的PIK3CA及IA型PI3K/Akt通路主要成员丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（pAkt）、细胞增殖相关核抗原（ki-67）的表达及相互关系，旨在探讨其在肿瘤增殖、侵袭与转移中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）组织芯片。组织芯片购自西安艾丽娜生物科技有限公司，包含胃腺癌及其匹配癌旁组织与正常胃黏膜组织组合微阵列，其中45例腺癌及其匹配的癌旁组织每例2点，10例正常组织每例1点。点数100，10×10排列，直径1 mm，厚度5 μm。在45例肿瘤样本中男33例，女12例，年龄30～78岁，中位年龄59岁，其中低分化腺癌8例，中分化腺癌28例，高分化腺癌9例；10例正常组织样本中男9例，女1例，年龄16～50岁，中位年龄37岁。芯片的每个点样均经过病理诊断。（2）试剂。鼠抗人PIK3CA单克隆抗体购自Abnova公司、兔抗人pAkt(1∶100)多克隆抗体、鼠抗人ki-67(1∶100)单克隆抗体购自Santa Cruz公司，山羊抗兔HRP二抗、马抗小鼠HRP二抗、DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学 组织芯片脱蜡至水，消除内源性过氧化物酶活性，抗原修复、室温孵育后，依次加1∶100稀释的一抗，弃一抗，0.01 mol/L PBS(pH7.2～7.4)冲洗，3 min，连续3次，加1∶100稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释)，37℃孵育30 min，滴加1∶100稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗，5 min，连续3次。常规脱水，透明、树脂封片，显微镜观察、拍照。以上免疫染色以PBS缓冲液替代一抗作为阴性对照。

1.2.2 免疫组化结果判定 PIK3CA、pAkt胞浆胞核出现DAB着色为阳性表达，ki-67只有细胞核着色时视为阳性表达，用装有目镜网格微测尺的200倍视野计数8个网格中的PIK3CA、pAkt、ki-67蛋白表达阳性和阴性的肿瘤细胞数，按各种蛋白阳性肿瘤细胞占所有肿瘤细胞总数的百分比，将其分为4个等级：无阳性细胞为-，阳性细胞lt;30%为+，阳性细胞30%～60%为++，阳性细胞gt;60%为+++。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行分析，各组间差异比较采用R×C列联表资料的χ2检验，蛋白阳性表达的相关性采用Spearman等级相关进行分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 胃腺癌、癌旁组织、正常胃黏膜组织中PIK3CA、pAkt、ki-67的表达 胃腺癌组织中PIK3CA、pAkt、ki-67免疫组化染色以+++为主，呈弥漫的棕黄色或棕褐色染色，相应的癌旁组织中PIK3CA、pAkt、ki-67免疫组化染色以++～+++为主，呈小灶或弥漫的棕黄色或棕褐色染色，正常胃黏膜组织中PIK3CA、pAkt、ki-67免疫组化染色阳性者均为+，点状棕黄色或棕褐色染色，见图1～3。PIK3CA、pAkt、ki-67在胃癌及其癌旁组织和正常胃黏膜组织中的表达阳性率差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。3种组织中PIK3CA与pAkt、ki-67表达均呈正相关（rs分别为0.916、0.945，均Plt;0.01），ki-67、pAkt表达亦呈正相关（rs=0.890,Plt;0.01）。

Table 1 Expressions of PIK3CA,pAkt and ki-67 in gastric carcinoma and adjacent tissues and normal gastric tissues表1 PIK3CA、pAkt和ki-67在胃癌及其癌旁组织和正常胃黏膜组织中的表达

2.2 不同病理级别胃腺癌中PIK3CA、pAkt、ki-67的表达情况 PIK3CA、pAkt、ki-67在低分化腺癌黏膜组织中染色以++～+++为主，呈弥漫的棕黄色或棕褐色染色，在中分化腺癌黏膜组织中染色以+～+++为主，呈小灶或弥漫的棕黄色或棕褐色染色，在高分化腺癌黏膜组织中染色多数为阴性，见图1～3。PIK3CA、pAkt、ki-67在不同病理级别胃癌中表达的阳性率差异有统计学意义（Plt;0.05），见表2。胃腺癌组织中PIK3CA与pAkt、ki-67表达均呈正相关（rs分别为0.885、0.934，均Plt;0.01），ki-67、pAkt表达亦呈正相关（rs=0.833,Plt;0.01）。

Table 2 Expressions of PIK3CA,pAkt and ki-67 in different pathological grades of gastric carcinoma表2 PIK3CA、pAkt和ki-67在不同病理级别胃癌中的表达

3 讨论

3.1 胃癌组织中PIK3CA表达与肿瘤发病的关系 本研究中PIK3CA在胃癌及其癌旁组织的阳性表达率明显高于正常胃黏膜组织，提示PIK3CA的过度表达在胃癌的发病中发挥了重要的作用。PIK3CA与pAkt在不同病理组织中表达的正相关，则进一步说明PIK3CA表达水平对PI3K/Akt信号通路活性存在影响，以往研究表明PIK3CA编码PI3K的催化亚基p110α，是PI3K/Akt信号通路中重要组成部分[5]，由此推断胃肿瘤组织中PIK3CA表达水平上调导致PI3Kp110α的催化活性增强，促使Akt磷酸化，进而激活PI3K/Akt信号传导途径，促进了胃肿瘤的发病。另外，ki-67是一种细胞增殖相关核抗原[6]，与细胞周期密切相关，能较好地反映肿瘤细胞的增殖活性。本研究中PIK3CA与ki-67在不同病理组织中表达的正相关，提示PIK3CA表达水平上调可能间接地促进了胃癌肿瘤细胞的增殖。

3.2 胃癌组织中PIK3CA表达与肿瘤分化程度的关系 本研究显示不同病理级别的胃腺癌组织中PIK3CA表达的差异具有统计学意义，说明PIK3CA高表达与胃癌细胞分化程度存在关联，越来越多的研究证明，PI3K/Akt信号通路中pAkt在调节细胞进程过程中起了重要作用，如细胞生长和增殖、细胞凋亡、细胞运动和侵袭，其机制可能为Akt的持续性表达能诱导上皮间质转变，赋予了组织侵袭和转移所需的运动性[7]。本研究中PIK3CA与pAkt的表达在不同病理分级的胃肿瘤组织中呈正相关，且PIK3CA、pAkt蛋白的表达阳性程度随胃腺癌的恶性程度的增高而增高，由此推测PIK3CA在胃肿瘤的增殖与分化中发挥了重要作用，其表达上调使其下游靶向分子Akt过度激活，进而产生一系列生物学行为。除此之外，本研究中，ki-67的表达也与PIK3CA、pAkt者之间存在正相关关系，说明在胃癌的发病中PIK3CA与肿瘤的增殖密切相关，其机制可能是PIK3CA作为PI3K/Akt信号通路的始动因子，促使Akt磷酸化，进而激活PI3K/Akt信号传导途径，促进胃癌增殖、侵袭与转移。联合检测这3个指标的表达程度，将进一步提高胃肿瘤的早期诊断率，估计患者预后，指导治疗。

Figure 1 Expressions of PIK3CA in different gastric tissues（Envision method×200）图1 PIK3CA在不同组织中的表达（Envision法×200）

Figure 3 Expressions of ki-67 in different gastric tissues（Envision method×200）图3 ki-67在不同组织中的表达（Envision法×200）

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