Beclin-1与Bcl-2在血管性痴呆大鼠海马CA1区的表达及意义*

袁 敏 刘 斌 唐 静 李世英

自噬(autophagy)是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，是真核细胞特有的生命现象[1]，它是细胞生长发育、分化成熟及死亡的重要调控机制[2]，与帕金森病[3]、阿尔茨海默病[4]和脑血管病[5]等多种疾病有关。Beclin-1为自噬相关基因，参与自噬体的形成，目前已作为自噬的标志分子用于检测自噬活性[6]。细胞凋亡与血管性痴呆（vascular dementia,VD）的发病过程关系密切[7]，但自噬和凋亡在VD发病过程中共同作用的研究较少。本研究旨在观察自噬相关蛋白Beclin-1与凋亡相关蛋白Bcl-2在VD大鼠海马CA1区的表达及变化情况，探讨其在VD发生、发展中的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物。清洁级健康雄性SD大鼠60只，体质量250～280 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号SCXK(京)2010-0013。在河北联合大学屏障环境动物实验室自由进食喂养，室温控制在（23±2）℃，自然光照，实验前适应喂养2周。（2）主要试剂和仪器。兔抗鼠Be⁃clin-1多克隆抗体、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗体、SP免疫组化试剂盒购自北京博奥森公司，DAB显色试剂盒、TUNEL检测试剂盒均购自北京中杉金桥公司。Morris水迷宫购自淮北正华生物仪器设备有限公司，电凝仪器购自张家港市航天医疗电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 大鼠随机分为假手术组和VD模型组，每组又随机分为模型制备成功后1、2、4、8、12周5个亚组（各6只）。

1.2.2 VD模型制备 采用改良Pulsinelli四血管阻断(4-VO)法制作VD模型[8]。大鼠于术前禁食12 h，用10%的水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉后，背侧颈正中切口，暴露双侧第一颈椎横突小孔，用直径0.5 mm电凝针插入双侧翼小孔烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞。再将大鼠仰卧固定，同时行腹侧颈正中切口，分离双侧颈总动脉，以4号丝线穿线备用。24 h后用微动脉夹夹闭双侧动脉5 min，共夹闭3次，每次间隔1 h。术后手术部位施以庆大霉素喷洒处理以抗感染，然后缝合，常规饲养观察。假手术组步骤同上，但不做缺血处理。术后连续3 d给予庆大霉素，预防感染。

1.2.3 学习记忆能力测试 在相应时间点前5 d，分别对各组大鼠采用Morris水迷宫实验测试学习记忆能力，包括定位航行试验和空间探索试验[9]。

1.2.4 标本制备 各组大鼠在学习记忆能力测试结束后，立即以致死量10%的水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉后，仰卧位固定于手术台上，剪开胸腔，暴露心脏，从心尖插入灌注针至左心室，同时剪开右心耳，快速滴入37℃生理盐水300 mL，无血污后改为滴入固定液4℃的多聚甲醛400 mL。待大鼠尾巴完全僵直时迅速断头，取出脑组织，固定于4%多聚甲醛溶液中12～24 h，进行脱水透明及石蜡包埋。冠状面连续切片，厚度约3 μm，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片捞片，晾干后置于60℃的烤箱中烘烤备用。

1.2.5 Beclin-1和Bcl-2检测 采用免疫组化SABC法，严格按照试剂说明书操作要求进行检测。阳性标准：光镜下观察，Beclin-1蛋白染色呈棕黄色颗粒，位于胞浆内；Bcl-2蛋白染色呈棕黄色颗粒，位于核膜或胞浆内。高倍镜下观察皮质缺血半暗带区不重叠的6个视野，进行Beclin-1、Bcl-2蛋白阳性细胞计数，计算阳性细胞平均数。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量数据以±ss表示，组间比较采用独立样本t检验，两变量间关系分析采用Pearson相关分析法，Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠学习记忆行为学结果 第1、2天，各组大鼠寻找平台的时间没有明显差异。从第3天起，模型组大鼠平均逃避潜伏期延长，穿越平台次数显著减少。

2.2 各组大鼠海马CA1区Beclin-1、Bcl-2蛋白表达结果 假手术组海马CA1区在不同时间点可见Beclin-1、Bcl-2蛋白阳性表达。模型组1周时可见Beclin-1、Bcl-2蛋白阳性表达，随着时间的延长逐渐增强，4周达至高峰，8周开始下降，至12周仍较高。与假手术组比较，模型组各时间点的Beclin-1、Bcl-2蛋白阳性细胞均明显增高，差异均有统计学意义（Plt;0.05或Plt;0.01），见表1、2，图1、2。

Table 1 Comparison of the positive expression of Beclin-1 in hippocampal CA1 area at different time points between two groups表1 2组大鼠海马CA1区不同时间点Beclin-1阳性表达数比较（n=6，个/高倍视野，x±s）

Table 2 Comparison of the positive expression of Bcl-2 in hippocampal CA1 area at different time points between two groups表2 各组大鼠海马CA1区不同时间点Bcl-2阳性表达数比较 （n=6，个/高倍视野，x±s）

2.3 VD大鼠海马CA1区Beclin-1与Bcl-2表达的关系 VD大鼠海马CA1区的Beclin-1与Bcl-2阳性表达数呈正相关（r=0.809，Plt;0.05）。

3 讨论

采用改良Pulsinelli四血管阻断(4-VO)法制备大鼠VD模型是较理想的VD动物模型。本研究应用Morris水迷宫实验进行学习记忆能力测试，观察各组大鼠的学习记忆能力，结果显示，模型组大鼠平均逃避潜伏期时间延长，穿越平台次数显著减少，符合VD模型判定标准，提示造模成功。

自噬是指细胞在自噬相关基因(autophagy relat⁃ed gene，Atg)的调控下利用溶酶体、噬泡降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程[10]，属于Ⅱ型程序性细胞死亡，主要由溶酶体酶激活来执行。Beclin-1是酵母At96/Vps30基因的同源物，Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(PI3K)可与Beclin-1形成复合物参与自噬体的形成。因此，Beclin-1是自噬的重要调节因子，其表达反映了自噬的活性[6]。本研究显示VD大鼠海马CA1区1周时Beclin-1表达升高，4周达到高峰，8周开始下降，至12周仍较高，模型组各时间点的Beclin-1表达均高于假手术组，说明在大鼠海马CA1区自噬明显增强，细胞自噬可能参与了VD的发生、发展和转归。

细胞凋亡是一种不同于坏死及自噬性死亡的细胞生理性死亡方式。细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡过程，Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡过程中发挥着至关重要的作用[11]，Bcl-2的高表达可阻止多种凋亡因子所致的细胞死亡，延长细胞寿命。在本实验中，VD大鼠海马CA1区1周时Bcl-2表达升高，4周达到高峰，8周开始下降，至12周仍较高。与假手术组比较，模型组各时间点的Bcl-2表达均明显增高，说明在VD大鼠海马CA1区存在细胞凋亡，细胞凋亡参与了VD的发病过程。

自噬是继坏死和凋亡后发现的第3种细胞死亡形式，与疾病的发生息息相关，是目前细胞领域研究的热点之一。自噬、凋亡和坏死3种现象在细胞应激状态下的发生顺序一直是国内外争论的热点。有研究者认为当细胞遭遇应激时，自噬最先被激活，当自噬不能维持细胞稳态后，细胞再继发凋亡，最后进入坏死[12]。也有研究者认为，自噬与凋亡重叠发生，平行执行功能，互为补充，共同维持细胞稳态，抵御应激损伤[13]。本研究显示，VD大鼠海马CA1区不同时间点自噬相关蛋白Beclin-1表达数与凋亡相关蛋白Bcl-2表达数呈正相关，表明血管性痴呆大鼠海马CA1区细胞自噬和凋亡同时发生，且表达趋势一致。

自噬与凋亡作为程序性细胞死亡的2种不同形式，二者之间可能存在复杂联系，对二者的深入研究，有助于揭示血管性痴呆发生发展过程的内在机制，为血管性痴呆的治疗提供新的理论依据。

Figure 1 The expression of Beclin-1 in hippocampal CA1 area of rats at different time points between two group（immunohistochemistry，×200）图1 各组大鼠海马CA1区不同时间点Beclin-1表达（免疫组化，×200）

Figure 2 The expression of Bcl-2 in hippocampal CA1 area at different time points between two group（immunohistochemistry，×200）图2 各组大鼠海马CA1区不同时间点Bcl-2表达（免疫组化，×200）

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