1种新型功能性杂交胰岛β细胞系的建立

李晓航，张佳林，李乐，康铁利，程颖，石蕊，张城硕，赵宁，刘永锋

（中国医科大学附属第一医院普通外科教研室，肝胆外科暨器官移植科，沈阳110001）

糖尿病是严重危害人类健康的常见病之一［1］。胰岛移植作为1种治疗Ⅰ型糖尿病的方法日益为人们所关注［2］。虽然胰岛移植在临床上取得了突破性进展，但是由于2个或多个供腺才能产生足够的胰岛素，它的推广应用受到了限制。因此，多渠道获得胰岛是解决胰岛不足的当务之急。目前，虽然在胰岛获得方面取得了一些经验，但在方法上都存在不同程度的缺陷［3～5］。电融合技术在杂交瘤细胞产生单克隆抗体领域已应用多年［6］。理论上，由正常胰岛β细胞与永生化细胞融合形成的细胞应该具备永生化细胞系的永生能力及正常胰岛β细胞的胰岛素生物合成及分泌特性。因此，本研究拟应用电融合技术构建1种与正常胰岛β细胞功能相似的大鼠杂交胰岛β细胞系。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠，雄性，体质量150～200 g，购自中国医科大学实验动物中心。胶原酶Ⅴ型、Ficoll 400、双硫腙、吖啶橙、碘化丙锭及Hoechst33258染液均购于美国Sigma公司；潮霉素购于瑞士Roche公司；猿猴病毒大 T 抗原基因（SV40 LTag）、胰岛素（insulin）、葡萄糖转运体-2（Glut-2）及葡萄糖激酶（GK）等蛋白抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；ELISA试剂盒购自美国RD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，于37℃、5%CO2孵箱内培养对照组RIN-m5F细胞。

1.2.2 原代成纤维细胞的获得及筛选：参照文献记载的胶原酶消化SD胎鼠皮肤获得［7］。我们在前期研究中已筛选出永生化成纤维细胞［8］。

1.2.3 胰岛细胞的准备及培养：按照文献［9］记载的胶原酶裂解SD大鼠胰腺获得新鲜大鼠胰岛，加入胰蛋白酶/EDTA和DNA酶制成单细胞悬液。加入含1.28 mmol/L钙及40 mg/mL牛血清白蛋白缓冲液中复苏细胞后，将细胞再次悬浮于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。

1.2.4 构建胰岛素分泌细胞系：将胰岛β细胞及永生化成纤维细胞悬浮于无菌的甘露醇基质的电融合缓冲液中（0.3 mmol/L甘露醇，0.5 mmol/L HEPES，0.05 mmol/L CaCl2，0.1 mmol/L MgSO4，0.05%BSA，pH7.2，滤器过滤除菌，4℃保存备用）。永生化成纤维细胞和胰岛β细胞按1︰5比例混合成6×106/mL的1 mL悬浮细胞电融合液，每次取40 μL细胞悬液移至电融合小室（ECM 830，美国BTX公司），调节电融合仪，使场强至1.6 kV/cm，脉冲宽度为40 μs，脉冲个数为3。采用AO/PI荧光染色法判定融合细胞活性＞80%。10 min后，将细胞融合混合液转移至24孔板培养。

1.2.5 胰岛素分泌细胞系的筛选及克隆杂交：将细胞融合混合液分入24孔板。通过ELISA试剂盒测定培养8 d的细胞中胰岛素的分泌量，并与正常胰岛β细胞进行比较。按照筛选流程，从孔板中筛选具有高胰岛素分泌量的细胞进行培养。筛选过程反复进行，最后分离并克隆出具有高胰岛素分泌量的细胞进行下一步研究。

1.2.6 细胞形态学观察：通过胰蛋白酶消化获得杂交胰岛β细胞，使细胞贴壁生长于6孔培养板中（5×105/孔）。PBS清洗2次，离心，弃上清。用2.5%戊二醛4℃固定2 h。观察细胞超显微结构。

1.2.7 测定杂交细胞胰岛素含量：接种杂交胰岛β细胞悬浮液（1×106/孔），过夜细胞贴壁生长，弃培养液，加入500 μL 酸乙醇（1.5%HCl，75%ethanol，23.5%去离子水）吹打，4℃过夜。收集上清测定细胞内的胰岛素含量。

1.2.8 杂交胰岛β细胞体外功能评价：在37℃孵箱内测定细胞对葡萄糖刺激胰岛素释放反应，测定胰岛素含量方法参照文献［10］。计数2×104个杂交胰岛β细胞，在含0.5%胎牛血清以及2.8 mmol/L或16.7mmol/L葡萄糖溶液的1.5 mL RPMI培养基中培养2 h。收集上清液，用ELISA试剂盒测定胰岛素含量。胰岛素释放指数通过高糖环境（16.7 mmol/L）与低糖环境（2.8mmol/L）的胰岛素含量做比计算获得。正常胰岛β细胞作为阳性对照。

1.2.9 细胞增殖分析：通过生长曲线法观察杂交胰岛β细胞增殖。将杂交胰岛β细胞接种于24孔板（1×104/孔），置于37℃、5%CO2孵箱中培养。接种时间记为1 d，之后每天取3孔计数，求平均值，连续测定8d。以培养时间（d）为横坐标，细胞密度（细胞数/mL）为纵坐标，绘制生长曲线。细胞培养使用不含生长激素的培养基。

1.2.10 半定量RT-PCR分析：使用Trizol提取杂交胰岛β细胞总RNA。用逆转录试剂盒合成cDNA。在包括1 μg逆转录产物、DNA聚合酶和0.4 μmol/L特异引物在内共计25 μg的反应体系内进行DNA扩增。引物序列及RT-PCR参数见表1。通过含有Genefinder（1︰10000）的2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并记录。以正常胰岛β细胞做为阳性对照。

1.2.11 Western blot：用细胞提取缓冲液裂解细胞，取15 mg蛋白质行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维薄膜。10%牛奶封闭，加入1︰200～1︰500稀释的一抗（鼠单克隆抗β-actin抗体，鼠单克隆抗SV40 LTag抗体，鼠单克隆抗胰岛素抗体，鼠单克隆抗Glut-2抗体及鼠单克隆抗GK抗体）孵育，加入标记辣根过氧化物酶的抗鼠IgG抗体的二抗，ECL显色。正常胰岛β细胞作阳性对照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 永生化成纤维细胞的建立

采用有限稀释法获得6个永生化成纤维细胞克隆，分别标记为1～6号。永生化成纤维细胞呈多角形或长梭形，与原代成纤维细胞无明显区别，其增殖能力明显高于原代成纤维细胞，RT-PCR及Western blot均可检测永生化成纤维细胞中SV40 Ltag的阳性表达［8］。

2.2 永生化杂交胰岛β细胞的建立

电融合3 d后细胞呈长梭形、多边形或不规则形，贴壁生长（图1A、1B）。经有限稀释法筛选出的杂交胰岛β细胞克隆呈短梭形或扁圆形，贴壁生长（图1C、1D）。共筛选出9个杂交胰岛β细胞克隆。透射电子显微镜下可见正常胰岛细胞内有较多胰岛素分泌颗粒（图2A、2B）；杂交胰岛β细胞内也可见散在分布的胰岛素分泌颗粒（图2C、2D）。

2.3 永生化杂交胰岛β细胞的特征

通过生长曲线观察杂交胰岛β细胞与永生化成纤维细胞之间的增殖能力无明显区别（P>0.05）（图3）。杂交和正常胰岛β细胞内胰岛素含量［分别为（227.40±7.90）和（246.32±8.82）μU/mL］无统计学差异（P>0.05）（图4）。正常胰岛β细胞在低糖和高糖刺激下胰岛素分泌量明显高于杂交胰岛β细胞（P<0.05）；但2者在胰岛素释放指数上无明显差别（表2）。RT-PCR及Western blot均可检测到杂交胰岛 β细胞SV40 LTag的表达（图5，图 6）。insulin、Glut-2和GKmRNA表达水平在正常及杂交胰岛β细胞中无显著差异（P>0.05），但均明显高于RIN-m5F 细胞（P<0.05）（图 7，图 8）。Western blot结果相似（图 9，图10）。

3 讨论

目前，胰岛移植是治疗糖尿病的最有效手段之一，而胰岛短缺是限制临床胰岛移植发展的主要障碍。因此，学者们尝试建立1种能稳定分泌胰岛素的细胞系，以期增加胰岛细胞来源。Narushima等［11］利用含有SV40 LTag和人端粒酶逆转录酶cDNAs重组逆转录病毒载体转染人胰岛β细胞，成功建立“永生化”人胰岛β细胞系（NAKT-15），是迄今为止最理想的1种β细胞系，能根据血糖的变化合成和分泌胰岛素。把该细胞移植到NOD/SCID小鼠体内，2周后血糖就降至正常水平，且未形成肿瘤，但是否有致瘤性仍有待于进一步研究。McClenaghan等［12，13］通过电融合法将NEDH大鼠胰岛β细胞和RIN-m5F细胞进行杂交融合，建立了3种新的克隆细胞系（BRIN-BG5、BRIN-BG7 和 BRIN-BD11），既有无限增殖潜能，又保持了正常胰腺β细胞的重要功能特征。其中功能最好的是BRIN-BD11细胞系，可持续稳定传代超过50代，胰岛素分泌能力及GSIS均较父代RIN-m5F细胞明显增强，与大鼠正常胰岛细胞极相似，且表达高水平Glut-2。体内实验表明，移植BRIN-BD11可有效控制糖尿病裸鼠的血糖水平［14］。

目前，NAKT-15及BRIN-BD11细胞系功能最为良好和稳定。然而，NAKT-15通过2次病毒感染筛选而来，操作复杂，耗时长，成本高。Barbu等［15］认为即使以感染效率高的腺病毒颗粒感染人或大鼠的胰岛细胞团，也仅有30%的胰岛细胞被感染，且主要为细胞团外围的非β细胞。因此，需要将胰岛细胞消化成单细胞再进行感染，但胰岛单细胞较娇嫩，且需要感染2次，故对胰岛细胞的需求量较大，限制了其应用。McClenaghan首次尝试应用电融合方法建立杂交胰岛β细胞系，取得了可喜的结果，但RIN-m5F为父代细胞之一，有潜在的致瘤性。

自McClenaghan应用电融合建立BRIN-BD11细胞系以后，电融合仪器已不断改善，能更精确地调节融合参数，控制融合过程。本研究尝试应用BTX公司ECM830电融合仪融合永生化成纤维细胞和胰岛单细胞，经有限稀释法已获得9个杂交胰岛β细胞克隆。经扩大培养检测发现杂交胰岛β细胞增殖能力明显改善，与永生化成纤维细胞接近。葡萄糖刺激胰岛素分泌试验证明杂交胰岛β细胞对血糖变化较敏感，与正常胰岛β细胞相比无显著差异。其细胞内胰岛素含量和正常胰岛β细胞相比也无明显差别，insulin、Glut-2和GK的相对表达量与正常胰岛细胞相比也无明显差别，均显著高于RIN-m5F细胞，提示此杂交胰岛β细胞既具有永生化成纤维细胞体外分裂增殖的能力，又具有胰岛β细胞合成分泌胰岛素的特性。虽然杂交胰岛β细胞对葡萄糖变化有一定敏感性，但分泌的胰岛素量较正常胰岛β细胞偏少，差异有统计学意义。然而，2种细胞内胰岛素含量无明显差异。提示杂交胰岛β细胞内胰岛素颗粒的转运和释放可能存在缺陷，因而将成为下一步研究的方向之一。

［1］Boyle JP，Honeycutt AA，Narayan KM，et al.Projection of diabete burden through2050：impact of changing demography and disease prevalence in the US［J］.Diabetes Care，2001，24（11）：1936-1940.

［2］Shapiro AM，Lakey JR，Ryan EA，et al.Islet transplantation in seven patients with type1diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressiveregimen［J］.NEnglJMed，2000，343（4）：230-238.

［3］Moritoh Y，Yamato E，Yasui Y，et al.Analysis of insulin-producing cells during in vitro differentiation from feeder-free embryonic stem cells［J］.Diabetes，2003，52（5）：1163-1168.

［4］Korsgren O，Buhler LH，Groth CG.Toward clinical trials of islet xenotransplantation ［J］.Xenotransplantation，2003，10 （4）：289-292.

［5］Beattie GM，Montgomery AM，Lopez AD，et al.A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function［J］.Diabetes，2002，51（12）：3435-3439.

［6］Kuriyama H，Shimizu K，Lee W，et al.Therapeutic vaccine generated by electrofusion of dentritic cells and tumor cells［J］.Dev Biol（Basel），2004，116：169-186.

［7］Westerman KA，Leboulch P.Reversible immortalization of mammalian cells mediated by retroviral transfer and site-specific recombination［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（17）：8971-8976.

［8］李晓航，张佳林，康铁利，等.Cre/LoxP系统联合SV40 LTag诱导可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系的建立［J］.中国医科大学学报，2011，40（11）：979-982.

［9］Gurol AO，Yillar G，Kursun AO，et al.A modified automated method for isolation of viable pancreatic islets in laboratory animals［J］.Transplant Proc，2004，36（5）：1526-1527.

［10］Korbutt GS，Elliot JF，Ao Z，et al.Large scale isolation，growth，and function of porcine neonatal islet cells［J］.J Clin Invest，1996，97（9）：2119-2129.

［11］Narushima M，Kobayashi N，Okitsu T，et al.A human beta-cell line for transplantation therapy to control type1diabetes ［J］.Nat Biotechnol，2005，23（10）：1274-1282.

［12］McClenaghan NH，Flatt PR.Engineering cultured insulin-secreting pancreatic B-cell lines［J］.J Mol Med，1999，77（1）：235-243.

［13］McClenaghan NH，Barnett CR，O′Harte FP，et al.Characteristics of BRIN-BG5 and BRIN-BG7，two novel glucose-responsive insulinsecretingcelllinesproducedbyelectrofusion［J］.JEndocrinol，1996，148（3）：409-417.

［14］Davies EL，Abdel-Wahab YH，Flatt PR，et al.Functional enhancement of electrofusion-derived BRIN-BD11 insulin-secreting cells after implantation into diabetic mice ［J］.Int J Exp Diabetes Res，2001，2（1）：29-36.

［15］Barbu AR，Bodin B，Welsh M，et al.A perfusion protocol for highly efficient transduction of intact pancreatic islets of Langerhans［J］.Diabetologia，2006，49（10）：2388-2391.