奶粉中叶酸生物传感器检测方法的研究与应用

孙明君，陈雍硕，郑小龙，陈启

（1.山东出入境检验检疫局食品农产品检测中心，山东 青岛 266002；2.GE Healthcare，上海 200000；3.浙江省疾控中心理化分析中心，浙江 杭州 310027）

叶酸是维持人体正常机能与代谢活动不可或缺的水溶性B族维生素，人体无法自行制造合成，必须额外补充。奶粉作为婴幼儿主要食品，其中叶酸的含量对婴儿健康的影响尤为重要。国家相关标准限制了奶粉中叶酸的添加量，但仍有不少市售奶粉存在叶酸的不合理添加。世界上许多国家和组织对奶粉中叶酸含量的检测建立了限制标准，例如AOAC OfficialMethod 992.05 Total Folate（Pteroylglutamic Acid）in Infant Formula Microbiological Methods First Action 1992 Final Action 1995。截至2010年，奶粉中叶酸主要检测方法有微生物检测法，理化检测法如HPLC和免疫检测法，这些方法样品前处理较为复杂，检测时间较长。

基于表面等离子体共振（SPR）技术的生物传感器是近年来发展起来的一种检测技术，具有实时监测分子间的相互作用、无需标记、定量准确等特点，已被广泛应用于药物研究[1-2]、食品分析[3-4]、环境监测[5-6]等领域。20世纪90年代瑞典的Biacore公司将SPR生物传感器技术引入兽药残留分析中，截至21世纪10年代已生产出多种检测试剂盒。国内已有利用SPR技术进行牛奶中磺胺甲恶唑检测研究[7]的报道。该技术的检测方法，具有样品前处理相对简单、高特异性、分析快捷、定量准确等优势[8]。本研究利用SPR技术，建立奶粉中叶酸的检测方法。该方法简单、快捷、灵敏度高，重复性好，适用于大规模的奶粉中叶酸的含量检测。

本实验基于Biacore 3000型表面等离子共振仪，采用竞争抑制法作为检测方法，测定婴幼儿配方奶粉中的叶酸含量。在奶粉样品中加入已知浓度的叶酸结合蛋白（folic acid binding protein，FABP），混合后的样品被流过预先包被过叶酸分子的传感芯片。样品中的叶酸分子会和FABP进行结合，而剩余的游离FABP则结合到芯片表面上的叶酸分子，因结合而产生的信号由仪器实时记录并输出。如果样品中的叶酸分子浓度越高，则游离的FABP越少，产生的信号也相对较低，反之亦然。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

奶粉（市售）；叶酸传感芯片（GE Healthcare）；叶酸结合蛋白（GE Healthcare）；超纯水、Pall 0.22μm 滤膜；1 mL一次性无菌注射器；离心管（1.5、2、50 mL）；100 mL棕色容量瓶；96孔板（圆底）；BT224S天平：Sartorius；PICO17离心机：Thermo；Biacore3000型表面等离子体共振仪：GE Healthcare；MLS-3750 高温灭菌锅：SANYO。

1.2 样品的前处理

精确称取1g奶粉样品到50mL离心管中，加35mL超纯水，振荡至完全溶解后于高温灭菌锅中105℃10 min（使样品中蛋白质失活）。取出冷却至室温，用超纯水将体积补到40mL，再用移液枪吸2mL样液至2mL离心管中，13000 r/min离心10 min，用1 mL一次性无菌注射器吸取1 mL中间的溶液部分（小心避开表层的脂肪层和底部的沉淀）过0.22μm滤膜到1.5 mL离心管中。

1.3 标准曲线的构建

用去离子水将标准样品母液（100μg/mL）稀释为1.23、3.70、11.1、33.3、80.0ng/mL。

该方法叶酸检测范围在2.0ng/mL～70ng/mL，最佳检测范围在10ng/mL～50ng/mL之间。

1.4 优化芯片和再生试剂

将叶酸传感芯片放入设备。缓冲液使用HBS-EP（0.01mol/LHEPES、0.15mol/LNaCl、3mmol/LEDTA、0.005%Surfactantp20），流速40μL/min。然后将50mmol/L氢氧化钠注射入系统，每次60 s，连续进样3次。再生试剂为50mmol/L氢氧化钠，流速40μL/min，进样时间30s。

1.5 样品检测

将样品和标准样品按照编辑好的程序并对应样品位置和体积用移液枪加样。加完样品后用铝箔条封盖96孔板，并放入仪器样品盘中。在1.5 mL离心管中分别加入对应体积的叶酸结合蛋白和再生试剂，并放入样品盘中，保存文件后，点击开始进行检测。

1.6 回收率试验

从10个检测样品中随机选取3个样品，每个样品加标量20ng/mL，做回收率试验。

2 结果与分析

2.1 再生条件的优化与芯片稳定性

采用甘氨酸、氢氧化钠以及氯化钠等试剂进行再生条件筛选。最终确定50mmol/L氢氧化钠，流速40μL/min，进样30 s作为再生条件。

将叶酸结合蛋白按1∶100稀释，进样时间60 s，流速40μL/min。再生条件为50 mmol/L氢氧化钠，流速40μL/mL，进样30 s。依照进样—再生的顺序作为一个循环，共进行50个循环进行芯片稳定性测试。结果如图。从基线信号和结合信号的趋势可以看出，每一次再生都可以将结合到芯片上的叶酸结合蛋白完全洗脱下，同时对蛋白的再次结合影响微乎其微。芯片稳定性测试结果见图1。

图1 芯片稳定性测试Fig.1 Stability test of chip

2.2 标准曲线的建立

根据在不同浓度下得到的结合信号，采用四因子非线性回归进行拟合，得到标准曲线见图2。

2.3 不同方法的样品测定结果的比较

目前，国标GB5413.16-2010《婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定》采用微生物法来测定婴幼儿食品和乳品中的叶酸含量，所以我们使用商品化试剂盒（拜发公司）采用微生物微量滴定法来作方法比较。对市售10个奶粉分别做了生物传感器与微生物法检测叶酸的试验，结果见表1。

图2 叶酸标准曲线Fig.2 Calibration curve or folic acid

表1 两种方法检测叶酸的数据结果Table 1 Analyses of comparing the data of folic acid assay in two different methods

日内精密度结果见表2。

表2 日内精密度数据（n=7）Table 2 Data of the intra-day precision

从试验数据来看，生物传感器方法所得结果与微生物法检测结果基本一致，相对标准偏差在10%以内，日内精密度试验所得结果也比较满意。

2.4 回收率

样品回收率结果见表3。

表3 样品回收率数据Table 3 Data of sample recovery rate

从10个检测样品中随机选取3个样品，编号分别是3、6、8号，每个样品加标量20ng/mL，并按照样品检测步骤做回收率试验。通过所检测的数据，计算后得到3号样品回收率为91.94%、6号样品回收率为96.41%、8号样品回收率为85.49%，结果在预期范围之内。

3 结论

本研究通过对照奶粉中添加不同质量浓度的叶酸得到标准曲线，与缓冲液[9]相比，更加合理，减少了奶粉样品中其他物质的影响，最低检测质量浓度为0.006μg/100 g。并且优化了再生条件，提高了芯片的稳定性。从10个样品的检测结果来看，与微生物法检测结果基本一致，相对标准偏差小于10%，日内精密度试验RSD为2.59%，随机选取的3个样品回收率在85.49%～96.41%之间。样品只需简单的稀释、离心处理即可直接检测，可以实测奶粉样品中的叶酸质量浓度范围为2.0ng/mL～70ng/mL。单个样品测量用时9 min，可在4 h内完成20个样品的结检测。相对传统的HPLC和GC检测技术，本方法样品前处理简单，同时也缩短了测量时间，是一种高效便捷的测量方法。

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[8]郭文林.利用表面等离子谐振免疫生物传感器检测动物组织中的兽药残留[J].中国兽药杂志,2004,38(11):31-36

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