牛肉和猪肉基质中多农药残留GCMS分析方法

刘润珠，王松，崔鹤，高建国，张靖坤，张文皓

（1.山东出入境检验检疫局食品农产品中心，山东青岛266002；2.青岛出入境检验检疫局，山东青岛266001；3.美国赛默飞世尔科技中国公司，山东青岛266032）

由于长期大量使用与滥用，农药已成为食品的重要污染源之一，特别是随着我国人民生活水平的提高，肉、水产品、蛋、乳类等动物源性食品在居民膳食结构中所占的比例越来越大。通过环境接触、食物链富集等进入动物体内的农药残留问题成为了关注热点[1-6]。

近年来我国在蔬果、茶叶等植物源性食品及水体、土壤等环境中的农残检测上已取得了较大进展，但针对动物源性食品农药残留检测，尤其是同时测定不同类型农药残留的多残留检测则较少研究，检测技术上的差距还导致我国出口动物源性食品遭遇欧美日等发达国家的技术性贸易壁垒。因此，提高我国动物源性食品农药多残留检测水平，显得十分重要和紧迫[7]。

凝胶渗透色谱法（gel-permeation chromatograph，GPC）是一项成熟的农药残留净化技术[8]，其主要原理是根据不同体积的分子在凝胶色谱柱保留的时间差异，来分离目标物。针对动物源样品中动物源样品中含有大量的脂肪、蛋白质和有机酸类物质，能把农药残留从各种复杂基质中分离出来，但同时有些近似分子量的干扰物可能会被夹带洗脱，不能达到完全净化，因此有时需要与其他技术连用，做进一步净化。我们以乙腈为溶剂，将动物源样品均质提取，提取液用GPC 除去脂类、蛋白质和大部分大分子杂质[9]，再经SAX/PSA 固相萃取[10]，进一步除去样品中可能含有的有机酸等极性杂质，此方法可以实现样品的无扰动分析，能够大幅提高萃取效率，可以使检测仪器的灵敏度提高。

1 材料和方法

1.1 仪器和材料

QP2010plus 气相色谱-质谱仪：岛津，配EI 源和自动进样器；T25 型均质器：IKA；39760 型旋转蒸发器：Thermolyne 公司；5810R 型离心机：Eppendorf 公司；凝胶色谱仪：L2，配有单元泵、馏分收集器。

30%丙酮/正己烷溶液（取300mL 丙酮，加入700mL正己烷，摇匀备用）；50%丙酮/正己烷溶液（取500 mL丙酮，加入500 mL 正己烷，摇匀备用）；50%环己烷/乙酸乙酯（取500 mL 环己烷和500 mL 正己烷，摇匀备用）；含500 ng 菲氘体的转溶液（取0.5 mL 的1 000 μg/mL菲氘体溶液加入500 mL 丙酮，500 mL 正己烷，摇匀备用）；NaCl 饱和2 mmol/L 磷酸缓冲溶液（量取1000 mL纯水，搅拌下加入210 g 磷酸氢二钾、120 g 磷酸二氢钾和200 gNaCl 至固体完全溶解，用NaOH 溶液调pH至7.5）；单标储备液（分别称取10 mg～20 mg 农药各标准物分别于10 mL 容量瓶中，用丙酮或乙腈定容至刻度，置于-18 ℃以下冷冻保存）；混合标准溶液（分别准确移取各种标准储备液，用丙酮配制成浓度为10 μg/mL的混合标准液，置于-18℃以下冷冻保存）。

1.2 方法

1.2.1 提取

称取10 g 试样（精确至0.01 g）于250 mL 烧杯中，加入乙腈40 mL、纯水10 mL，棒状均质器约10 000 r/min下均质提取2 min，然后抽滤（若不能顺利滤下，可在样品中加1 g～2 g 硅藻土），用15 mL 乙腈分两次清洗均质杯，并入接收瓶。将提取溶液调pH 至中性，然后转入已盛有NaCl 的分液漏斗中，少量乙腈冲洗烧杯，振荡3 min，静置10 min。弃去水层，取乙腈层于蒸馏瓶内，乙腈冲洗蒸馏瓶瓶口，用旋转蒸发器于40 ℃下减压浓缩至干。加入10 mL50%环己烷/乙酸乙酯溶解残渣，用0.45 μm 滤膜过滤，待凝胶色谱（GPC）净化。

1.2.2 凝胶色谱（GPC）净化

凝胶净化柱：Bio Beads S-X3 7 mm×250 mm；流动相：50%环己烷/乙酸乙酯；流速：4.7 mL/min；样品定量环：10 mL；预淋洗时间：10 min；凝胶色谱平衡时间：5 min；收集时间：23 min～31 min。将10 mL 待净化液进行净化，收集23 min～31 min 区间的组分，于40 ℃下浓缩至近干，待固相萃取净化。

1.2.3 固相萃取（SPE）净化

SAX/PSA 柱预先用30 %的丙酮/正己烷溶液（5 mL×2）平衡，3 mL 30%的丙酮/正己烷溶液加入蒸馏瓶内，移入柱内，50 mL 蒸馏瓶接收，使用30 mL 30%丙酮/正己烷冲洗蒸馏瓶，并移入SAX/PSA 柱进行洗脱接收，当液面降至与填料齐平时，该流出液作为第一部分；再用50%的丙酮/正己烷溶液30 mL 洗脱，真空抽干，流出液作为第二部分。第一部分、第二部分分别使用旋转蒸发器在40 ℃下减压浓缩至近干，氮气吹干，以含500 ng 菲氘体的转溶液定容2 mL 后，用于气相色谱-质谱测定。

1.2.4 仪器测定

色谱柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛细管柱或相当者；色谱柱温度：60 ℃保持3 min，然后以10 ℃/min 程序升温至150 ℃，再以2 ℃/min 升温至220 ℃，再以10 ℃/min 升温至280 ℃，保持9 min；载气：氦气，纯度≥99.999 %，流速：1 mL/min；进样口温度：260 ℃；进样量：1 μL；进样方式：无分流进样，2 min后开阀；电子轰击源：70 eV；离子源温度：200 ℃；GCMS 接口温度：280 ℃；选择离子监测：多离子监测；溶剂延迟：8 min。

2 结果与讨论

2.1 结果分析

在确定的仪器条件下，50、100、200 μg/L 3 种浓度，三点线性相关系数均超过0.999，通过S/N=10 计算得仪器定量限在1.0 μg/kg～13.9 μg/kg，方法定量限为0.2 μg/kg～2.8 μg/kg，均小于10 μg/kg 的一律基准要求，完全满足大规模筛查的需要。

同时，通过对牛肉、猪肉两种基体进行50、100、200 μg/kg 3 种不同浓度的添加回收实验，回收率在65.1%～124.7%，由于测定项目较多，其中由于动物源性基质的成分较为复杂，虽通过GPC 与SPE 两种净化手段仍在部分农药测定方面存在很强的基质效应，因此，检测过程中使用了基质标准进行定量。

2.2 讨论

2.2.1 提取溶剂的选择

目前多农残分析中主要使用的提取溶剂为丙酮、乙腈和乙酸乙酯，其中丙酮与水良好的互溶性会在净化过程中带来一定的繁琐；而乙酸乙酯对于非极性杂质，特别是甾醇类等大分子杂质的提取效率相对较高，因此目前主流的多农药残留分析方法一般均采用乙腈作为提取溶剂。我们在这个方法中也选择了乙腈作为提取溶剂，取得了满意的结果。提取过程中选择

乙腈作为溶剂，加入水的主要目的是为了润湿样品，增加乙腈对肌肉的渗透性，可将肌肉组织分散的非常均匀，提高提取效率[11]。

表1 质谱相关检测参数Table1 Mass spectrometry detection parameters

2.2.2 净化

2.2.2.1 SPE 净化柱选择

从SPE 柱的填料性质分析，SAX/PSA 双层小柱含有上层的SAX 和下层的PSA 两种填料，综合了SAX 和PSA 的优势，SAX 可吸附基质中几乎所有的酸性杂质，PSA 可有效去除食品中的脂肪酸，有机酸、极性色素和糖类。由于动物源基质中经过GPC 处理后，已经去除大部分的大分子杂质干扰，其余干扰物多为脂肪酸、有机酸类物质，选用SAX/PSA 作为SPE 过程的净化柱，能有效得去除干扰杂质。

2.2.2.2 pH 调节

在液液分配过程中水相的pH 对于农药的回收率有着相当大的影响：在酸性条件下，存在某些农药回收率较低的情况；而大部分有机磷农药在碱性条件下存在不稳定性，为了保证在液液分配过程的稳定性，因此在液液分配过程中需要使用缓冲溶液调整pH 到中性。

2.2.2.3 浓缩

在最后旋转浓缩过程中，实验发现浓缩的方式和程度对于易挥发组分尤其是DDVP 的回收率影响相当大，氮吹至干的时候一般DDVP 的回收率都会低于30%，而使用旋转浓缩的方式浓缩至近干的时候回收率会相对较好，特别是在浓缩前加入少量正十烷，一方面可以防止最后浓缩至近干时敌敌畏的损失，另一方面在气相检测的时候高沸点溶剂起到溶剂聚焦的作用有利于改善峰形。

3 结论

本方法针对于动物源产品中经常检出的208 种农药，建立了凝胶色谱/固相萃取气质联用检测分析方法。本方法的净化力度比较大，对于目前常见样品，这个方法足以满足日本肯定列表一律基准的要求，但是综合来讲，这个方法的净化步骤较多，净化步骤越多，前处理过程中出现损失的可能就越多，因此对于这个方法的日常使用来讲，人员操作的熟练程度和实验室整体质量控制质量保证手段决定了这个方法的实际应用效果。另外，由于本方法包括的农药面比较宽，极性分布比较广，有利于今后新农药品种的增减。

[1] 仲维科,郝戬,孙梅心,等.我国食品的农药污染问题[J].农药,2000,39(7):1-4

[2] 赵云峰,吴永宁,王绪卿,等.中国居民膳食中农药残留的研究[J].中华流行病学杂志,2003,24(8):661-664

[3] 汪建红,李雪红,张保欣.动物源性食品的药物残留和化学污染物对人类毒性作用及畜产品安全达标对策[J].新疆畜牧业,2003(2):8-9

[4] 文利侠,李舒强.动物源性食品安全问题与对策[J].畜牧兽医杂志,2013,32(1):69-74

[5] 韦凤栖,莫静波.食品中农药残留检测的样品前处理技术进展[J].中国卫生检验杂志,2012,22(3):678-680

[6] 程文杰.食品中农药残留检测技术研究进展[J].中国卫生检验杂志),2011,2(2):534-535

[7] 李君君,李力军,徐惠诚,等.动物源性食品中农药多残留检测前处理技术研究进展[J].中国食品卫生杂志,2012,24(4):403-407

[8] 费勇,杨晓红,张海燕,等.全自动凝胶色谱净化-气相色谱法同时测定淡水鱼类中多氯联苯和有机氯农药等36 种残留有机物[J].中国环境监测,2011(2):63-68

[9] 杨立新,苗虹,曾凡刚,等.动物源性食品中有机磷农药残留检测技术研究进展[J].中国食品卫生杂志,2010,29(3):241-244

[10] SCHENCK F J.DONOGHUE D J.Determination of Organochlorine and Oranophosphorus Pesticide Residues in Eggs Using a Phase Extraction Cleanup[J].J Agric Food Chem,2000,48(12):6412-6415

[11] 苏建峰,林谷园,连文浩,等.两种水产品中农药多残留分析的样品前处理方法及其在111 种农药和相关化学品残留同时检测中的应用[J].色谱,2008,26(3):292-300