应用HPLC-ICP-MS法同时测定富硒大蒜中砷的形态

2013-01-30陈晞何桂华韩焕美郑新华张爱霞

食品研究与开发 2013年22期

陈晞，何桂华，韩焕美，郑新华，张爱霞

（1.济南出入境检验检疫局，山东济南250014；2.山东大学化学与化工学院，山东济南250014）

硒是人体必需的微量元素，对预防疾病、增进健康和防止衰老具有重要意义，被誉为“生命的保护剂”[1]。由于富硒蔬菜具有高产量、高附加值的优势，且植物源性有机态硒更安全、更有效，是人体摄入硒的最有益途径，因此富硒蔬菜成为目前蔬菜产品开发的热点[2]。然而，富硒地区土壤常伴生重金属污染，作物吸收一定浓度硒元素的同时会加剧对重金属元素的富集，严重影响蔬菜产品质量安全[3]。

砷元素是重金属主要污染物之一，各种砷化物毒性与其形态密切相关，无机砷（As（Ⅲ）和As（V））毒性最强，有机态的一甲基砷、二甲基砷等毒性较低，砷糖、砷胆碱等有机砷类无毒。大蒜是对硒元素有较强的富集作用，其硒含量约为其他蔬菜的10 倍左右，通过摄入富硒大蒜可有效改善人体缺硒状况。在大蒜种植过程中施加硒元素可提高砷元素的转移效率，增加砷元素在大蒜中的含量，影响产品质量安全。因此，准确检测富硒大蒜中的无机砷含量对提高富硒大蒜产品质量具有重要指导意义，对我国制订富硒蔬菜产品生产规范提供了检测依据。课题组在前期工作基础上，采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）联用技术测定了富硒大蒜中五种砷的形态，分离效果和定量结果均令人满意。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

富硒大蒜：超市采购，产地分别为济南、潍坊、莱芜；砷酸根（32.4 μmol/g）、亚砷酸根（124.3 μmol/g）、一甲基砷（46.2 μmol/g）、二甲基砷（0.706 μmol/g）、砷甜菜碱标液（0.518 μmol/g）：中国计量科学研究院；硝酸铵、磷酸氢二铵：国产优级纯。实验用水为Millipore 超纯水机制备的超纯水，符合GB 6682-1992《分析实验室用水规格和试验方法》所规定的一级水标准。

1.2 仪器与设备

7500cx 电感耦合等离子体质谱仪、1200 高效液相色谱：美国安捷伦公司；高速冷冻离心机：日本日立公司；刀式研磨仪：德国莱驰公司；恒温水浴摇床：美国热电公司；精密酸度计：上海雷磁仪器厂；AL104 分析天平：梅特勒-托利多国际股份有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 前处理方法

取富硒大蒜可食部分，使用刀式研磨仪粉碎均匀。准确称取2.00 g（精确到0.01 g）样品于50 mL 离心管中，加入20 mL 超纯水，涡流混匀，超声萃取40 min，于4 ℃下转速8 000 r/min 冷冻离心15 min，上清液过0.45 μm 水相滤膜上机测定。同时进行试剂空白试验。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Dionex IonPac As11 阴离子色谱分析柱（含保护柱）；流动相：5 mmol/L 磷酸氢二铵溶液+10 mmol/L硝酸铵溶液（氨水调节pH 为9.2）；流速1.0 mL/min；进样量40 μL。

1.3.3 ICP-MS 条件

RF 功率：1 600 W；载气流速：15 L/min；辅助气流速：1 L/min；雾化气流速：1 L/min；蠕动泵转速：0.3 r/min；采样深度：8.0mm；提取透镜：-120V；Omega 透镜：-16V。

1.3.4 标准工作溶液配制

分别用超纯水将砷甜菜碱、一甲基砷、二甲基砷、砷酸根和亚砷酸根的标准储备溶液逐级稀释，配制成0、1.0、10.0、20.0、50.00 和100.0 ng/mL 的砷形态混合标准系列，超纯水为标准空白。采集空白及标准溶液系列，计算各色谱峰的积分面积，绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

常见砷形态的离解常数pKа 分别为：亚砷酸根（As（III））：9.2；砷酸根（As（V））：2.3、6.8、11.6；一甲基砷酸（MMA）：2.6、8.2；二甲基砷酸（DMA）：6.2；砷甜菜碱（AsB）：2.2。由此可见各形态均可电离成离子态，且各形态解离常数差别较大，故可选用阴离子色谱柱分析。

磷酸盐作为常用阴离子淋洗液，作为无机砷的基础淋洗液较为合适。考虑到与钠盐相比，铵盐对ICPMS 采样锥和截取锥的伤害更小，故选择磷酸氢二铵作为基础淋洗液。大蒜样品中氯化物含量较高，加入硝酸铵可以改变氯离子的出峰时间，避免氯化物对As测定的干扰；同时，硝酸铵也可改善As（V）的保留时间。有文献表明在加入甲醇或乙醇后As 测定的灵敏度可增高[4]，但实验发现，有机试剂的加入对阴离子柱和ICP-MS 的炬管、采样锥寿命均有明显影响，导致检测成本过高。经优化，最终选择5 mmol/L 磷酸氢二铵溶液+10 mmol/L 硝酸铵溶液（氨水调节pH 为9.2）作为流动相。为提高检测灵敏度，将进样量增大到40 μL。

图1 为流动相流速1.0 ml/min 时5 种砷形态标准品（50 μg/L）分离的色谱图（a）和大蒜样品测量谱图（b）。由图1 可知，5 种形态砷完全基线分离，峰型对称、尖锐，保留时间稳定，可以满足实际样品检测需要。

图1 5 种砷形态标准溶液色谱图（a）和大蒜样品测量谱图（b）Fig.1 Chromatogram of five arsenic species（a）and of the garlic sample

2.2 ICP-MS 条件优化

考虑到砷的电离能较高，将RF 功率适当增高至1 600 W，保证砷的各形态均可完全解离以满足测定要求。因联机后流动相流速达1.0 mL/min，为避免废液不能及时排出对仪器造成损坏，将蠕动泵转速提高至0.3 r/min。联机前，使用1.0 mg/L 的Li、Y、Co、Ce、Tl 混合调谐液对ICP-MS 进行调谐，调整载气流速、采样深度、炬管位置、透镜参数等指标，以保证仪器的最佳状态和仪器状态的稳定性。调谐后，仪器灵敏度明显提高，中质量数（Y）>500 Mcps/ppm，同时使氧化物CeO/Ce<3%，双电荷产率Ce2+/Ce+<1.5%。

2.3 提取条件优化

试验比较了盐酸提取、沸水提取、超声提取3 种处理方式的提取效果。结果表明，盐酸提取液氯离子浓度过高，解离后出现极宽的干扰峰，造成标准品峰形无法分辨，基线漂移漂移严重，无法达到定量分析的要求，故不采用该方式提取。

图2 为沸水提取（a）和超声萃取（b）时提取时间对5 种砷形态回收率的影响。

图2 沸水提取（a）和超声萃取（b）时提取时间对5 种砷形态回收率的影响Fig.2 Effect of the time on the recoveries of 5 arsenic species with extraction of boiling water（a）and ultrasonic（b）

由图2 可见，沸水提取时，提取效率与时间密切相关，短时间内砷酸根和亚砷酸根的提取效率随时间延长而提高，但时间延长至40 min 左右时，部分亚砷酸根氧化为砷酸根，回收率反而降低，该方法耗时长、无机砷回收不稳定，有机砷回收率也不高，需进一步优化。超声萃取具有耗时短、样品无交叉污染，适合批量样品测定，经加标回收实验，超声萃取40 min，5 种形态的砷回收率均在90%以上，满足检测需要。

2.4 工作曲线和方法检出限

对浓度分别为0、1.0，10.0、20.0、50.00、100.0 ng/mL的砷形态混合标准溶液进行HPLC-ICP-Ms 分析，以峰面积对浓度进行线性回归。结果表明，在该浓度范围内，5 种砷形态的线性回归方程相关系数均在0.999以上。对标准溶液进行逐级稀释，以10 倍信噪比（S/N）作为定量检出限。线性回归方程、相关系数及检出限见表1。

表1 5 种砷形态的线性回归方程及相关系数（r2）Table 1 Linear regression equations and correlation coefficients of 5 arsenic species

2.5 回收率与精密度

选取市售富硒大蒜，采用微波消解-ICP-MS 法测定其总砷含量，选择总砷含量为未检出者作为空白样品进行加标回收试验。取空白的富硒大蒜样品可食部分，使用刀式研磨仪粉碎均匀。准确称取2.00 g（精确到0.01 g）样品于50 mL 离心管中，分别加入0.50、1.0、50.0 μg/kg 5 种形态砷混合标准溶液，加入20 mL 超纯水，涡流混匀，超声萃取40 min，于4 ℃下转速8 000 r/min 冷冻离心15 min，上清液过0.45 μm 水相滤膜上机，测定并计算回收率和精密度（n=6）。测得平均回收率范围在89.5%～108.2%之间，相对标准偏差在0.68%～4.2%之间（见表2）。空白大蒜样品（a）和加标大蒜样品（b）的HPLC-ICP-MS 色谱图见图3，加标浓度50 μg/kg。

表2 5 种形态砷标液的添加回收率和精密度（n=6）Table 2 Spiked recoveries and precisions for 5 arsenic species（n=6）

图3 空白样品（a）和加标样品（b）的HPLC-ICP-MS 色谱图Fig.3 HPLC-ICP-MS chromatograms of the blank sample（a）and the sample spiked with 5 arsenic species（b）

2.6 市售富硒大蒜样品检测

选购市售富硒大蒜样品，按所建立的HPLC-ICPMS 方法测定5 种砷的形态，同时测定总砷含量，结果见表3。

表3 市售富硒大蒜检测结果Table 3 Analytical results of selenium-enriched garlic μg/kg

结果表明，富硒大蒜中的砷元素主要以MMA 形态存在，另有少量五价砷。研究表明，一甲基砷酸毒性与As（III）和As（V）相比更低，较二甲基砷、砷糖、砷胆碱毒性更高[5]。总砷含量比5 种形态砷元素检测结果总和略高，应是无毒的砷糖、砷胆碱类存在。所测富硒大蒜中总砷含量均很低，远低于GB 2762-2012《食品安全国家标准食品中污染物限量》所规定的总砷≤0.5 mg/kg。这与富硒蔬菜种植一般采用基地管理，对土壤、灌溉水、肥料中重金属含量进行严格控制密切相关。