柱前衍生超高效液相色谱－串联四极杆质谱法测定仙草多糖组成及其含量

张维冰，王智聪，张凌怡，钱俊红

(华东理工大学 化学与分子工程学院，上海 200237)

仙草又名凉粉草、烧仙草，为唇形科仙草属一年生草本植物，具有“清暑热，解藏府热毒”的功效。仙草多糖是仙草中含有的一种具有凝胶性的多糖［1］，研究显示植物多糖具有广泛的药理作用，参与机体各种生理代谢，具有调节机体免疫功能、抑制肿瘤、抗衰老、抗病毒、降血脂、降血糖、抗氧化等多种生物活性［2］。杨敏等［3］用仙草多糖对大鼠肝匀浆进行体外抗氧化试验，发现其具有显著的抗脂质过氧化作用。此外，仙草多糖还具有良好的保健性能，但这种多糖在人们日常饮食中含量极少［4］。

多糖的单糖组成测定是控制多糖质量标准和提供多糖基本信息的最重要环节。单糖分析有其自身的特点，必须具有高效的分离技术、高灵敏度的检测方法，方可实现多糖组成成分的分析及其含量测定。由于糖的特殊结构，其本身不含紫外和荧光吸收的官能团，在反相色谱柱上不保留，也不便于质谱直接检测。因此最常用的是采用衍生方法，不仅可提高检测灵敏度，也便于糖的分离。根据衍生原理的不同，除常用的反相液相色谱(RP HPLC)分离外，还可以采用毛细管区带电泳(CZE)、毛细管电泳(CE)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、气相色谱(GC)等进行单糖衍生产物的分离，常用的检测方法有紫外、荧光、质谱等［5－10］。衍生可与糖的还原端反应，也可与糖的非还原端反应，如利用氨基、羟基或羧基进行衍生。在与糖的还原端反应中，常用的方法为还原胺化法，衍生试剂有2-氨基吡啶(2-AP)、8-萘胺-1，3，6-三磺酸(ANTS)、7-萘胺-1，3-二磺酸(ANDS)、2-氨基吖啶酮(2-AMAC)、2-氨基苯甲酰胺(2-ABM)、4-氨基苯甲酸(4-ABA)等。除了还原胺化法外，还有其他与糖的还原端反应的衍生化方法，如1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)等，近年来在PMP的基础上发展了一些改进的衍生方法，如采用衍生试剂:1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMPMP)［11］，4-(3-甲基-5-氧-2-吡唑啉基)苯甲酸(PMPA)［12］，1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)［13］，1-(4-异丙基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(PPMP)［14］等。冯涛等［4，15－17］采用还原胺化试剂(4-ABA)衍生单糖然后进行液相色谱分析，并将单糖还原成相应的乙酸醛醇后用气相色谱分析了仙草多糖的单糖组成，林少琴等［18］对纯化后的仙草多糖采用薄层层析的方法测定了其单糖组成。由于PMP衍生反应条件温和，可以与还原糖进行定量反应，且衍生产物无立体异构体，并具有较强的紫外吸收，易于质子化，而采用质谱进行检测。PMP柱前衍生液相色谱测定单糖的方法经过不断发展和完善，已广泛用于植物多糖组成成分的分析，如花楸、沙参、当归、藤三七、芜菁、淫羊藿多糖等［19－24］。

在上述多糖的单糖组成测定中，因植物提取物成分复杂，需对植物多糖进行纯化精制，单糖的衍生产物和杂质必须有足够的分离度以避免液相分离中杂质干扰。另外，多糖水解产物中单糖的含量差异较大，对低含量单糖，采用常规紫外方法进行检测的误差较大，对鼠李糖和核糖也无法实现有效分离。本文采用固相萃取方法纯化多糖粗提液，简化了样品精制的过程，使用PMP柱前衍生，串联四极杆质谱检测。该方法具有非常高的灵敏度与选择性，可对样品中低含量单糖进行准确测定。同时，本文测定了仙草多糖水解产生的单糖以及仙草中游离的单糖，对仙草中糖的研究具有非常重要的意义。

1 实验部分

1.1 仪器、药品与试剂

ACQUITY UPLC/TQD超高效液相色谱－串联四极杆质谱系统、Sep－Pak C18固相萃取柱(Waters公司);AG 285型电子天平(Mettler Toledo公司);Millipore超纯水仪(美国密理博公司);5810 R冷冻离心机(德国Eppendorf公司);KQ-250B超声波清洗器(昆州市超声仪器有限公司);HWS 24型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司);202-OA型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

甘露糖(Man)、鼠李糖(Rham)、核糖(Rib)、葡萄糖醛酸(GluA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)和岩藻糖(Fuc)对照品(Sigma公司);乙腈、甲醇(色谱纯，Merck公司);三氟乙酸、乙酸、乙酸铵(色谱纯，Sigma公司);碳酸钠、氢氧化钠、浓盐酸、氯仿(分析纯，上海国药集团);1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(Sigma公司);实验用水均为超纯水;仙草采自福建武平。

1.2 实验方法

1.2.1 工作溶液的配制 对照品溶液:称取适量甘露糖、鼠李糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖对照品，加适量水超声溶解，配制成浓度均为0.1 mol/L的母液，再用水稀释成浓度为1、2.5、5、10、25、50、75、100 μmol/L的对照品混合工作溶液;内标溶液:称取适量岩藻糖对照品，加适量水超声溶解，使其浓度均为6.1 mmol/L，再用水稀释成浓度为50 μmol/L的内标工作溶液;衍生试剂溶液:称取适量1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，加甲醇超声溶解，浓度为0.5 mol/L。

1.2.2 仙草多糖的提取与纯化 仙草全草经过洗涤、晒干、切断、粉碎、过筛(20目)后，按照文献［25］的方法适当修改后提取仙草中的多糖，具体步骤为:称取适量上述过筛后的仙草原料样品，按照料液比1∶30，加0.3%碳酸钠溶液浸泡0.5 h，再置于沸水浴中浸提1.5 h，取出冷却，并以4 000 r/min离心10 min，上清液即为仙草多糖粗提液。固相萃取柱先后各用2 mL甲醇、水活化，取上述仙草多糖粗提液2 mL上样，收集洗脱液备用。

1.2.3 多糖水解 取“1.2.2”固相萃取后的洗脱液1 mL，加2 mL 4 mol/L三氟乙酸水溶液，漩涡混合，置于110℃烘箱反应3 h，取出冷却至室温，加2 mL 4 mol/L NaOH溶液中和，漩涡混合后于4 000 r/min离心10 min。

1.2.4 单糖衍生 取“1.2.1”的对照品工作溶液50 μL及“1.2.3”仙草多糖水解上清液50 μL，加50 μL内标工作溶液、50 μL 0.3 mol/L NaOH溶液、50 μL 0.5 mol/L PMP溶液，漩涡混合，置于70℃水浴反应30 min，取出冷却至室温。加50 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和、0.7 mL水稀释、0.7 mL氯仿萃取，充分振荡后离心，弃去下层有机相，用氯仿重复萃取2次，上层水相经12 000 r/min离心5 min后，取上清液供液相色谱分析。

1.3 色谱条件

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm i.d.×50 mm，1.7 μm);流动相A为含0.5 mmol/L乙酸铵及0.05%乙酸的水溶液，流动相B为乙腈;梯度洗脱:0～2 min，15%～17%B，2～3 min，17%～20%B，3～6 min，20%～21%B，6～6.1 min，21%～95%B，6.1～8 min，95%B，8～8.1 min，95%～15%B，8.1～10 min，15%B;流速0.5 mL/min;柱温35℃;自动进样器温度10℃;进样量2 μL。

1.4 质谱条件

ES正离子模式，毛细管电压3.0 kV，离子源温度150℃，脱溶剂气(氮气)温度400℃，雾化气(氮气)流速800 L/h，锥孔气(氮气)流速50 L/h，碰撞气(氩气)流速0.13 mL/min，MRM多反应监测，驻留时间0.075 s，锥孔电压50 V，碰撞电压25 V，质谱数据采集时间2.3～6.3 min，色谱流出物在0～2.3 min及6.3～10 min通过阀切换到废液。

2 结果与讨论

2.1 多糖的提取与纯化

植物提取物成分复杂，已有文献对多糖的单糖组成进行测定时，大多需要对植物多糖进行纯化精制，如经过石油醚脱脂、乙醇洗涤、水提取、沉淀蛋白、有机溶剂洗涤等多个过程［23］。上述精制过程不仅步骤繁琐，小分子糖也被除去。本文采用固相萃取的净化方法，由于单糖及多糖在C18柱上不保留，样品经固相萃取后，不仅可以除去脂肪、部分黄酮等干扰杂质，而且保留了仙草粗提液中的小分子糖，有利于全面了解仙草全草中糖的组成及含量。与多糖精制的样品前处理方法相比，本文的方法简单、快速、容易操作。

2.2 多糖水解条件的优化

三氟乙酸、硫酸常用来水解多糖。杨兴斌等［21］在当归多糖分析中，比较了三氟乙酸、硫酸及其混酸对多糖水解的影响，发现分别采用三氟乙酸或硫酸的效果差别不大，而混酸效果不好。本实验比较了4 mol/L三氟乙酸和4 mol/L硫酸对仙草多糖水解的影响，发现采用硫酸水解后单糖含量非常低，因此后续实验中采用三氟乙酸水解多糖。

考察了不同水解时间对水解单糖含量的影响，结果如图1所示。随着水解时间的增加，葡萄糖醛酸的含量逐渐增加，甘露糖、鼠李糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖在水解1 h后其含量缓慢下降，而半乳糖醛酸随着水解时间的增加含量也逐渐增加，在3 h达到最大，之后随着水解时间的增加其含量逐渐降低。在仙草多糖中，半乳糖醛酸是其特征性的糖酸［26］，综合考虑，实验中将多糖水解3 h。

图1 水解时间对单糖含量的影响Fig.1 Effect of hydrolysis time on monosaccharide content

单糖与衍生试剂需在弱碱性条件下进行反应，水解后需要调整水解液的pH值。实验比较了氮气吹干和氢氧化钠中和的效果。多糖水解中使用三氟乙酸，由于其具有挥发性，可以采用氮气吹干的方法，如Duanaliella salina多糖的分析［27］、茶多糖的分析［28］。同时在质谱检测中，为了避免引入无机盐，氮气吹干也是较好的方法。但在本实验中采用氮气吹干时，仙草多糖水解后的单糖含量非常低，原因尚不清楚，因此实验改用氢氧化钠进行中和，此时单糖衍生产物的信号明显提高，中和产生的无机盐通过阀切换的方法在进入质谱前导入废液。

2.3 单糖衍生条件的优化

Susumu等［29］采用葡萄糖为模型，对衍生条件进行了优化，发现使用0.3 mol/L NaOH、0.5 mol/L PMP在70℃反应30 min时达到最佳的回收率。文献中使用50 μL 0.5 mol/L PMP溶液，衍生试剂大大过量，本实验曾尝试减小衍生试剂的用量，采用单糖混合对照品考察了衍生试剂用量的影响。实验发现，使用50 μL浓度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mol/L的PMP溶液时，随着PMP浓度的减小，单糖衍生产物的信号变小。而对100 μmol/L的8个混合对照品工作溶液，使用50 μL 0.02 mol/L PMP溶液，按照单糖与衍生试剂摩尔比1∶2进行计算，理论上衍生试剂过量11.8倍，但实验中发现衍生产物的信号非常小，因此本实验使用50 μL 0.5 mol/L的衍生试剂。

Dai等［27］在对Duanaliella salina多糖的分析中，考察了衍生反应时间的影响，发现反应100 min时衍生产物的信号响应达到最大，比反应30 min高出30%。Lü等［28］在对茶多糖的分析研究中，采用类似的条件衍生反应60 min。对不同的样品，最佳衍生反应时间可能不同，本实验考察了30、45、60、90、120 min衍生反应时间的影响，结果发现，增加反应时间对衍生产物信号的影响较小，故本实验采用30 min为最佳衍生反应时间。

2.4 液相色谱及质谱条件的优化

在液相色谱紫外检测中，通常采用磷酸盐－乙腈体系进行洗脱，但在质谱检测中，不能使用不挥发性的盐。实验首先考察了乙酸水溶液－乙腈体系的效果，但发现葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸以及葡萄糖和半乳糖的分离度不好，甚至分不开。在水相中添加5 mmol/L乙酸铵后，分离度明显改善，但质谱信号受到明显抑制，为兼顾分离度和灵敏度，采用0.5 mmol/L乙酸铵+0.05%乙酸水溶液的效果较好，结果如图2所示。

图2 单糖混合对照品及内标的多反应监测谱图Fig.2 MRM chromatograms of monosaccharide mixture standards and internal standard

理论上单糖与衍生试剂PMP按照摩尔比1∶2进行反应，但实际上在衍生反应中应添加过量的衍生试剂，虽然采用氯仿反萃取可以除去大部分过量的衍生试剂，但对于质谱，剩余的PMP浓度很高。在UPLC－PDA－MS/MS联用的紫外检测通道中，保留时间1.9 min时出现信号非常强的衍生试剂PMP的色谱峰，因此在进入质谱之前需要除去过量的PMP。同时，在多糖水解后，添加氢氧化钠进行中和，产生了大量的无机盐;在单糖衍生后，添加盐酸进行中和，也产生了大量的无机盐，因此色谱流出物不能直接导入质谱。由于无机盐在反相色谱柱中不保留，将0～2.3 min的色谱流出物通过阀切换到废液，不仅去除了无机盐，同时去除了过量的衍生试剂PMP。

2.5 线性关系与检出限

表1 8种单糖的线性方程、相关系数及检出限Table 1 Linear equations，correlation coefficients(r2)and method detection limits(MDL)of eight monosaccharides

对系列浓度的对照品工作溶液进行衍生后，按照优化条件进行分析。以岩藻糖为内标，内标法进行定量。以单糖浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。结果显示，各单糖在1～100 μmol/L范围内呈良好线性关系，相关系数r2均大于0.96。对1 μmol/L的混合对照品溶液进行分析，以S/N=3计算方法检出限(MDL)，各单糖的检出限均不高于12.3 nmol/L(见表1)。

2.6 准确度与精密度

配制浓度为10、25、50 μmol/L的质量控制溶液，按照优化条件进行分析，各浓度分别配制3个平行样品，并且分3批进行考察，对每一浓度水平，以9次测定的平均值与理论添加值相比计算回收率表示方法的准确度;同时，以9次测定的相对标准偏差表示方法的精密度，结果见表2。各单糖的回收率在84%～112%之间，相对标准偏差均不高于4.7%。方法显示了良好的准确度与精密度。

表2 8种单糖的回收率与相对标准偏差(n=9)Table 2 Recoveries and RSDs of eight monosaccharides(n=9)

2.7 仙草多糖的组成分析及单糖含量测定

按优化条件对仙草多糖进行提取、水解、衍生后，进行测定分析，样品平行测定3次，结果用平均值 ±标准偏差(SD)来表示(如表3所示)。从表3可知，仙草多糖中含量最高的是半乳糖醛酸和葡萄糖，占总糖组成的50%以上，其次是半乳糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖等。

表3 仙草多糖的单糖组成及含量Table 3 Composition and content of monosaccharides in Mesona Chinensis Benth polysaccharides

根据相关文献报道，林少琴等［18］对仙草多糖进行分离纯化后，得到酸性杂多糖，其单糖组成为葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖醛酸及一种未知单糖。Feng等［16－17］将仙草多糖纯化精制后，用离子交换树脂进一步分离，得到1种中性多糖和1种酸性多糖，分别对其水解、衍生、色谱分析后，发现中性多糖中葡萄糖占35%，半乳糖占23%，木糖和阿拉伯糖约占30%，不含半乳糖醛酸;而在酸性多糖中，半乳糖醛酸占49%，木糖和阿拉伯糖约占30%，葡萄糖和半乳糖分别占2%和5.5%。比较两种单糖组成，发现酸性多糖中半乳糖醛酸的含量较高，而中性多糖中葡萄糖和半乳糖的含量较高。本实验测定的单糖中，葡萄糖和半乳糖分别占26.5%和16.4%，半乳糖醛酸占28.4%，表明既包含中性多糖又包含酸性多糖水解产生的单糖，因此，与Feng等［16－17］的实验结果相比，葡萄糖和半乳糖的含量比中性多糖少，而比酸性多糖多，对于半乳糖醛酸，其含量比中性多糖多，而比酸性多糖少。同时，本实验测定的单糖中不仅包含仙草多糖水解产生的单糖，也包含仙草中游离的单糖，能更真实地反映仙草全草中糖的组成及其含量。

图3为仙草样品的色谱图。从图中可观察到鼠李糖和核糖的保留时间一致不能分开，但其分子量不同，因此在质谱通道可以得到很好的分离。在质谱Mass Scan扫描中，对保留时间3.2 min的组分提取离子质谱图，得到481.2和495.2两个单糖衍生加合物的离子，证实为鼠李糖和核糖。采用紫外检测器对植物多糖的单糖组成分析中均未包含核糖［19－23］，因为核糖和鼠李糖在液相色谱中不能分开，因此对鼠李糖的定量造成影响。另外，对木糖和阿拉伯糖，本实验中液相色谱不能将其分开，由于其分子量一致，质谱也不能分开，因此在仙草样品定量分析中，木糖含量实为木糖与阿拉伯糖含量的总和。在质谱Mass Scan扫描中，对保留时间5.2 min组分的提取离子质谱图(如图4所示)，只检测到481.2的离子，为分子量150的单糖的衍生加合物。由Feng等［16－17］的分析结果来看，无论是仙草中性多糖还是酸性多糖，阿拉伯糖的含量均比木糖高，进一步说明质谱通道中保留时间5.2 min的组分是木糖与阿拉伯糖，而在本文中用木糖含量表示木糖与阿拉伯糖的总量。

图3 仙草样品的色谱图Fig.3 MRM chromatograms of Mesona Chinensis Benth 1－9 were the same as those in Fig.2，10.arabinose

3 结论

本文建立了1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生超高效液相色谱－串联四极杆质谱测定8种单糖的方法，并成功用于仙草多糖的单糖组成分析。实验简化了仙草多糖的净化步骤，优化了多糖水解、单糖衍生及色谱质谱分离分析的方法。采用超高效液相色谱－串联四极杆质谱检测，分析时间短，灵敏度高，重现性好。结果表明，仙草多糖由甘露糖、鼠李糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖8种单糖组成，其摩尔百分比分别为7.4%、5.7%、4.2%、0.9%、28.4%、26.5%、16.4%和10.6%。

图4 仙草样品在质谱Mass scan扫描中对保留时间5.2 min组分提取的离子质谱图Fig.4 Extracted ions spectrum of Mesona Chinensis Benth under Mass Scan at retention time 5.2 min

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