凝胶渗透色谱－固相萃取/高效液相色谱法同时测定水产品中甲基睾酮与己烯雌酚

李佩佩，郭远明，陈雪昌，张小军，梅光明，刘 琴

(浙江省海洋水产研究所 浙江省海水增养殖重点实验室，浙江 舟山 316100)

甲基睾酮(Methyltestosterone，MET)和己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)属同化激素，分别作为人工合成的雄性和雌性激素，对促进蛋白合成和提高产量具有较强作用，可大幅度提高动物养殖的经济效益［1］。然而其在人体的极小残留也会造成人内分泌紊乱、性早熟、胎体中毒、致畸致癌等严重后果［1］。因此美国和欧盟等国家和组织通过立法限制或禁止食用性动物饲养中使用此类激素［2］，我国农业部也将这两种激素列入禁止用于所有食品动物药品目录［3］。有资料报道水产业饲料中有甲基睾酮和己烯雌酚违法添加现象，因此快速、准确检测这两种激素对于水产品安全监控具有重要意义。

目前甲基睾酮和己烯雌酚的检测方法主要有气相色谱－质谱法［4－6］、高效液相色谱法［7－9］、高效液相色谱－串联质谱法［10－15］等。已有的水产行业标准将甲基睾酮和己烯雌酚分别测定，也有文献采用液相色谱－质谱法将两者与其它同化激素同时测定［16］。本文采用凝胶渗透色谱净化样品，经固相萃取再次净化后进高效液相色谱测定水产品中的甲基睾酮和己烯雌酚，成功解决了同化激素前处理过程中的基质干扰问题。本方法回收率较高、检出限较低、检测效率较高，适用于水产品中两种激素的同时常规检测，同时也适用于脂肪含量较高的水产品。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱仪(配2489紫外检测器，美国Waters公司);GPC Ultra全自动凝胶净化在线浓缩系统(德国LCtech公司);T18匀浆机、MS2漩涡混合器(德国IKA公司);Centrifuge 5810高速离心机(Eppendorf公司);N－EVAP112氮吹仪(Organomation公司);R－215旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司);固相萃取装置(美国Agilent公司);Oasis HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL，美国Waters公司)。

甲基睾酮、己烯雌酚标准品(纯度＞99%，德国Dr Ehrenstorfer公司):分别用甲醇溶解并配制成100 mg/L的标准储备液，再根据需要稀释成相应的混合标准工作液。乙醚、甲酸、甲醇(色谱纯)，环己烷、乙酸乙酯(农残级)均为Merck公司产品;Na2CO3(分析纯，上海国药试剂集团);实验用水为Milli-Q制备超纯水;其他试剂均为分析纯。

1.2 样品前处理

实验所用的水产品为草鱼、对虾和鳗鲡，按照SC/T3016的规定处理后于－18℃冰箱密封保存。

称取(5±0.02)g充分匀浆的样品于50 mL离心管中，加入15 mL乙醚和2 mL 10%的Na2CO3溶液，加塞漩涡混匀5 min，超声提取5 min，6 000 r/min离心5 min，吸取上清液至100 mL鸡心瓶中，向下层残渣中再加入15 mL乙醚重复提取一次，合并上清液至鸡心瓶中于35℃下缓慢旋转蒸干。用10 mL乙酸乙酯－环己烷(1∶1，体积比)分两次充分溶解残渣，经0.45 μm有机滤膜过滤后转移至GPC专用浓缩小瓶中。放置好浓缩瓶和收集瓶，开始GPC净化。收集24～35 min的馏分，40℃下氮吹至干。加入4 mL 10%的甲醇水溶液，漩涡混匀后过HLB柱(使用前用4 mL甲醇和4 mL水活化)，以20%甲醇水溶液淋洗，低真空抽干或挤干，以4 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于40℃水浴下氮吹至干，残渣用1 mL流动相充分溶解，经0.22 μm滤膜过滤后进HPLC检测。

1.3 色谱条件

色谱柱:X－Bridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇－水(72∶28);流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;进样量:20 μL;检测器:紫外检测器，检测波长:254 nm。

1.4 GPC条件

柱子类型:GPC 10010(500 mm×25 mm);填料:50.0 g Bio－Beads SX－3(中性、多孔的聚苯乙烯－二乙烯基苯微球体;排斥极限:相对分子质量400～14 000)，柱床高32 cm;流动相:乙酸乙酯－环己烷(1∶1);流速:5.0 mL/min;样品定量环:5.0 mL，浓缩至2 mL;预淋洗体积:85 mL;洗脱体积:50 mL;清洗体积:35 mL。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

己烯雌酚易溶于乙醇、乙醚、氯仿、脂肪油或强碱溶液;甲基睾酮极性稍低于己烯雌酚，易溶于乙醇、丙酮、氯仿和醚类［1］。文献报道常用甲醇作为两者的提取剂［11］，而甲醇易溶于水且沸点较高，不易蒸干，考虑到后续GPC净化要求无水，因此选择不溶于水且易蒸干的乙醚作为提取液。实验表明乙醚对两者的提取效率均在90%以上。

2.2 GPC净化条件的确定

甲基睾酮和己烯雌酚同属蛋白同化激素，脂溶性强，基质效应严重，有效去除杂质是准确定量和实现低检出限的关键。本实验采用凝胶渗透色谱(GPC)净化样品。GPC基于分子大小分离原理，可有效去除色素、油脂等干扰物，常用于农药的多残留分析，但应用于激素类药物残留分析的报道并不多见。孙汉文等［17］利用凝胶渗透－固相萃取技术检测了牛肉中甲基睾酮等9种类固醇激素;谢维平等［18］采用凝胶渗透色谱净化/高效液相色谱法测定了鱼肉中己烯雌酚等5种激素。GPC净化的关键是选择合适的切割时间以有效去除脂肪并保证药物的回收率。本实验采用GPC标准柱，参考给出的农药标准净化条件，根据甲基睾酮和己烯雌酚的结构和性质，改变了洗脱时间和主收集时间，用50 μg/kg的基质加标样品进GPC净化，根据色谱标准曲线计算回收率并考察除脂效果(见表1)。在表1中方案1即1 200～2 160 min的实验条件下，杂质去除较为理想且两种药物的回收率均在85%以上。故选择24～36 min作为收集时间。为更好地去除杂质干扰，进一步降低检出限，GPC净化后的样品再过HLB固相萃取柱进一步净化。

表1 3种GPC条件及回收率比较Table 1 Comparison of three GPC conditions and recoveries

2.3 检测波长的选择

同化激素在紫外区有较强吸收，根据这两种激素对紫外光的吸收性质，分别于245、254 nm波长下对其进行同时检测，发现254 nm时两者分离效果好、响应值较高，谱图基线较平稳，基质加标样品在此波长下干扰较低，故选择最佳检测波长为254 nm。

图1 0.5 mg/L混合标准溶液(A)及鳗鲡样品加标50.0 μg/kg MET和DES(B)的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of 0.5 mg/L mixed standard solution(A)and blank eel sample spiked with 50.0 μg/kg MET and DES standard(B)

2.4 流动相的选择

采用甲醇－水(73∶27)为流动相测定空白基质加标样品，己烯雌酚在约4.8 min出峰，甲基睾酮在约6.8 min出峰，而杂质峰最后流出时间为4.2 min左右，和己烯雌酚的保留时间较为接近。当测定较低浓度的加标样品时发现杂质峰对己烯雌酚峰有影响，干扰定量分析，也易出现样品假阳性问题，因此逐步降低了有机相比例以延长两种激素的保留时间，最终确定流动相为甲醇－水(72∶28)。此条件下，两者的保留时间均推迟了约2.5 min，消除了杂质干扰。0.5 mg/L混合标准溶液的液相色谱图和鳗鲡样品加标50.0 μg/kg MET和DES的色谱图见图1。

2.5 线性范围与检出限

用甲基睾酮和己烯雌酚混合标准溶液配制质量浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.5、2.0 mg/L的标准工作溶液，进样后制作标准曲线，计算线性方程、相关系数及线性范围。将空白样品加标液逐级稀释，取信噪比S/N=3的样品浓度为方法检出限(LOD)，取信噪比S/N=10的样品浓度为方法定量下限(LOQ)。结果表明，两种激素在各自线性范围内，峰面积(Y)与其质量浓度(X)呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999(见表2)。方法检出限和定量下限均可满足实际检测的需要。

2.6 方法回收率与精密度

选择鳗鲡和对虾作为空白样品，添加10.0、50.0、200 μg/kg 3个水平的混合标准溶液做加标回收实验，计算其回收率和精密度，采用50.0 μg/kg添加水平连续测定5 d，计算日间精密度，结果如表3所示。2种激素的平均回收率在84%～93%之间，日内精密度和日间精密度均小于6.0%。

表2 甲基睾酮与己烯雌酚的线性方程、线性范围、相关系数(r)、检出限及定量下限Table 2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients(r)，detection limits(LODs)and quantitation limits(LOQs)of MET and DES

表3 样品中甲基睾酮和己烯雌酚的加标回收率及相对标准偏差(n=5)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of MET and DES(n=5)

2.7 实际样品分析

应用建立的方法对舟山市场上购得的罗非鱼、对虾和鳗鲡各10个样品进行肌肉中甲基睾酮和己烯雌酚残留量的测定。结果在这些样品中均未检出这两种激素，表明该批样品无甲基睾酮和己烯雌酚的安全隐患。

3 结论

本实验建立了水产品中甲基睾酮和己烯雌酚残留的凝胶渗透色谱－固相萃取净化/高效液相色谱检测方法，通过GPC的良好净化能力，有效降低了基质干扰，简化了实验步骤，提高了方法的检测灵敏度，分离效果良好，可满足日常监测工作的需要。

［1］Li J S，Qiu Y M，Wang C.Analysis of Veterinary Drug Residues.Shanghai:Shanghai Science and Technology Press.(李俊锁，邱月明，王超.兽药残留分析.上海:上海科学技术出版社)，2002:256－299.

［2］Commission of the European Communities.Council Directive 96/23/EC.Off.J.Eur.Commun.，1996，L125:10.

［3］The Chinese Ministry of Agriculture，Bulletin No.235.Maximum Residue Limits of Veterinary Drug in Animal Derived Foods(农业部.中华人民共和国农业部公告第235号.动物性食品中兽药最高残留限量)，2002.

［4］Daeseleire E，De Guesquiere A，Van Peteghem C.J.Chromatogr.B，1991，562:673－679.

［5］Garcia I，Luisa，Sarabia L A，Cruz Ortiz M，Aldama J M.Anal.Chim.Acta，2005，544(1/2):26 －35.

［6］Impens S，De Wasch K，Cornelis M，De Brabander H F.J.Chromatogr.A，2002，970:235－247.

［7］Jiang J，Lin H，Fu X T，Li M M.J.Ocean Univ.China，2005，4(3):248 －251.

［8］Romsing S，Ulfberg J，Bergovist Y.Scand.J.Clin.Lab.Invest.，2003，63(1):81 －88.

［9］Marwah S，Marwah P，Lardy H.J.Chromatogr.B，2005，824:107 －115.

［10］Chu P S，Lopez M，Serfling S，Gieseker C，Reimschuessel R.J.Agric.Food Chem.，2006，54(9):3193－3198.

［11］Nie J R，Li D G，Deng X L，Lian J，Hong Z T.Chin.J.Veter.Drug(聂建荣，李大光，邓香连，连槿，洪振涛.中国兽药杂志)，2009，43(4):20－22.

［12］Shao B，Zhao R，Meng J，Xue Y，Wu G H，Hu J Y，Tu X M.Anal.Chim.Acta，2005，548:41－50.

［13］Qin Y，Chen J，Zhang M J.Chin.J.Anal.Chem.(秦燕，陈捷，张美金.分析化学)，2006，34(3):298－302.

［14］Xu Y J，Tian X H，Zhang X Z，Gong X H，Zhang S J，Liu H H.J.Instrum.Anal.(徐英江，田秀慧，张秀珍，宫向红，张世娟，刘慧慧.分析测试学报)，2010，29(2):152－156.

［15］Jia Y B，Wang H Q，Han L M.J.Instrum.Anal.(贾彦博，王红青，韩里明.分析测试学报)，2011，30(7):808－812.

［16］Chen H H，Ying Y F，Wu P G，Wei M J，Zhu C Y，Qu J，Chen M Q.Chin.J.Anal.Chem.(陈慧华，应永飞，吴平谷，韦敏珏，朱聪英，屈健，陈熳茜.分析化学)，2009，37(2):181－186.

［17］Sun H W，Kang Z X，Li H.Chin.J.Anal.Chem.(孙汉文，康占省，李挥.分析化学)，2010，38(9):1272－1276.

［18］Xie W P，Ouyang Y L，Huang Y Y，Chen C Z.Chin.J.Chromatogr.(谢维平，欧阳燕玲，黄盈煜，陈春祝.色谱)，2010，28(4):388－392.