猪牙皂正丁醇提取物含药血清抑制人肝癌细胞SMMC-7721的实验研究*

汪红卫 张赤志 许汉林 陈 成 蔡 岳 王晓东

1.湖北中医药大学2010级博士生部 (湖北武汉，430061) 2.湖北省中医院 3.湖北中医药大学药学院 4.湖北中医药大学2012级博士生部

原发性肝癌是一种全球性高度恶性的肿瘤［1］，病机十分复杂。中医对其治疗有许多探讨，从痰论治原发性肝癌［2］是主要方法之一，涉及多味化痰中药［3，4］，皂荚为其中一种［5］。猪牙皂为豆科植物皂荚已衰老或受伤后所结之果实，弯曲成月牙形，又称小皂荚［6］;性味辛咸、温、有毒;入肺、胃、大肠经，《汤液本草》云:“入厥阴经”;功用:通窍、涤痰、搜风、杀虫［7］。本实验采用猪牙皂正丁醇提取物的含药血清，体外实验抑制人肝癌细胞SMMC-7721，利用噻唑蓝还原法(MTT法)检测其抑制率，以观察猪牙皂的抗肝癌效果。

1 材料与方法

1.1 细胞及动物 人肝癌SMMC-772l细胞，购于基尔顿生物科技 (上海)有限公司。Wistar雄性大鼠40只，SPF级，体重 (200±20)g，购于湖北省实验动物研究中心，许可证号:SCXK(鄂)2008-005。

1.2 药物 中药猪牙皂购于湖北省药材公司，猪牙皂正丁醇提取物由湖北中医药大学药学院制备。

1.3 主要实验仪器 微量移液器 (芬兰大龙移液器)、超净工作台 (苏州集团安泰空气技术有限公司，型号SW-CJ-1FD)、CO2恒温培养箱 (SANYO公司，型号 MCO-15AC)、倒置显微镜 (OLYMPUS公司，型号IX51)、低温离心机 (OLYMPUS公司，型号IX51)、低速离心机 (Eppendorf公司，型号 5702R)、酶标仪 (Thermo公司，型号 MULTISKAN MK3)。

1.4 主要实验试剂及耗材 0.25%胰蛋白酶、胎牛血清及DMEM培养基为美国Gibco公司产品，MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒为南京凯基生物科技公司产品，细胞培养皿及细胞培养瓶购自美国Corning公司。

1.5 实验步骤

1.5.1 猪牙皂正丁醇提取物含药血清的制备 40只Wistar雄性大鼠随机分为4组，即:对照组，正丁醇提取物含药血清按低、中、高剂量组，每组10只大鼠。根据人临床用量(猪牙皂生药量1.5g·70kg-1·d-1)、人与大鼠的等效剂量倍数，倍增至7倍为实验低剂量，按1∶2∶4，设置正丁醇提取物低剂量 (0.15g·kg-1·d-1)组、中剂量 (0.3g·kg-1·d-1)组和高剂量 (0.6g·kg-1·d-1)组，用生理盐水稀释至等体积灌胃给药，对照组大鼠给予等体积生理盐水灌胃，2次/d，连续2天。第3天上午再给全日剂量灌胃1次 (灌胃前禁食不禁水12小时)，于给药后0.5～1小时，心脏采血，离心分离血清，合并同组血清，56℃水浴灭活30分钟，用0.22 μm一次性无菌滤器过滤除菌、分装，置-20℃冰箱保存备用。

1.5.2 细胞培养 人肝癌SMMC-7721细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5%CO2培养箱中常规培养。细胞长满单层铺满培养瓶后，加入适量0.25%的胰蛋白酶液消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.5.3 MTT法测定细胞抑制率 取对数生长期细胞，分别收集计数并调整细胞密度为4×104个/ml，96孔板每孔接入100μl细胞悬液，同时设空白对照组，即孔内加入100μl DMEM培养基，不含细胞，再加入200μl无菌PBS;每组设置5个复孔，37℃，5%CO2继续培养24小时;吸出孔内细胞培养液，加入预先配置好的含药血清 DMEM培养基200μl(DMEM:含药血清 =180μl∶20μl)，37℃，5%CO2继续培养24小时;小心吸出孔内液体，加入预先配置好混匀的含MTT的 DMEM 培养基 100μl(DMEM:MTT=90μl:10μl)，37℃，5%CO2继续培养4小时;小心吸出孔内液体，加入二甲基亚砜 (Gibco公司)150μl/孔，室温低速振荡10～15分钟，使紫色结晶充分溶解;用酶标仪测定各孔在波长为492 nm时光密度值(optical density，OD)，细胞抑制率计算公式:生长抑制率 (%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

2 结果

表1 猪牙皂正丁醇提取物含药血清对人肝癌细胞SMMC-7721存活的影响(，n=5)

表1 猪牙皂正丁醇提取物含药血清对人肝癌细胞SMMC-7721存活的影响(，n=5)

*与对照组相比，差异有统计学意义;△与高剂量组相比，差异有统计学意义。

图1 猪牙皂提取物正丁醇部位含药血清对人SMMC-7721肝癌细胞的存活影响(检验水准为α=0.008)

如表1和图1结果所示:低剂量组与对照组比较差异有统计学意义;中剂量组与对照组比较差异有统计学意义，与高剂量比较差异有统计学意义，与低剂量组比较差异无统计学意义;高剂量与对照组比较差异无统计学意义。

3 讨论

原发性肝癌是我国传统医药治疗中最常见到效果的肿瘤之一，中医以整体观念根据患者的全身特点辨证论治，可以适用于各型各期肝癌［8］。药物体外抑制肝癌细胞的实验较多，大多结论提示:对肝癌细胞的抑制效果随着药物剂量的增加而增强。本实验结果却提示:猪牙皂正丁醇提取物中、低剂量组能够抑制人肝癌细胞SMMC-7721，高剂量组却没有抑制作用。

药物在机体产生的药理作用和效应，受药物和机体多种因素的影响。药物因素主要有药物剂型、剂量和给药途径、合并用药与药物相互作用等;机体因素主要有年龄、性别、种族、遗传变异、心理、生理和病理因素［9］。合理用药，需要结合药物代谢动力学和临床、实验具体方案，来调控药物作用的性质、强度和时间，以增强疗效，防止和减轻其毒副作用［10］。本实验药物剂量与效应关系，与药物动力学最大效应的概念一致，即:最大效应随着剂量或浓度的增加，效应也增加，当效应增加到一定程度后，若继续增加药物浓度或剂量而其效应不再继续增强，这一药理效应的极限称为最大效应。这种现象与临床中药物的“天花板效应”相似，如:像弱阿片类中的部分激动剂，因为和受体结合后只产生部分效应，而随着与受体结合的增多，反而会产生拮抗作用。这提示我们实验与临床用药时应寻找最佳药效的药物剂量，但这一现象的确切原因和机制尚待进一步深入研究和探讨。

［1］胡品津，刘新光.消化内科学 ［M］.北京:人民卫生出版社，2008:188.

［2］汪红卫，张赤志，蔡岳，等.从痰瘀论治原发性肝癌 ［J］.国际中医中药杂志，2013，35(2)，145-146.

［3］杨宗辉，尹建元，魏征人，等.天南星提取物诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其机制的实验研究 ［J］.中国老年学杂志，2007，27(2):142-144.

［4］王庆才.生南星、生半夏在肿瘤临床中的应用［J］.辽宁中医杂志，1993，20(3):37-38.

［5］杜进军，张赤志，许汉林，等.皂荚提取物对肝癌细胞小鼠Smad4及Smad7基因调控的影响 ［J］.中西医结合肝病杂志，2010，20(3):164-165，177.

［6］高学敏.中药学［M］.北京:中国中医出版社，2007:351.

［7］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海:上海科学技术出版社，1986:2198.

［8］中国抗癌协会肝癌专业委员会，中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会，中华医学会肝病学分会肝癌学组.原发性肝癌规范化诊治的专家共识［J］.临床肝胆病杂志，2009，25(2):91.

［9］杨宝峰.药理学［M］.北京:人民卫生出版社，2008:27-36.

［10］徐淑云.临床药理学［M］.北京:人民卫生出版社，1999:33.