合肥首例恙虫病病人血中东方体56 kDa外膜蛋白部分基因的扩增及进化分析*

操 敏 耿美玲 陈乐如 毛应华谭伟龙 王长军 朱 进 王忠灿

(南京军区疾病预防控制中心, 南京 210002)

恙虫病是东方体Orientiatsutsugamushi感染引起的虫媒自然疫源性疾病，以鼠类为主要传染源,通过恙螨幼虫叮咬而引起传播。临床上以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为特征。1986年以来，我国恙虫病发病人数呈逐年增多态势，每年发病数都在2 000例以上,恙虫病疫源地也逐步北移(吴光华，2000)。

恙虫病在安徽省属新发传染病。历史上仅休宁1982年报告1例病例(胡成炎，1983), 接下来25年无病例报。但自2007年安徽三界驻军部队出现暴发流行以来(汪茂荣等,2008)，近几年在阜阳、蚌埠等地频现恙虫病疫情(吴家兵等,2009)，提示安徽省可能广泛存在恙虫病疫源地。本研究采用恙虫病胶体金诊断试剂对合肥一例不明发热病人进行快速诊断，对病人血DNA用恙虫病东方体特异性引物进行PCR 扩增，并对扩增片段进行序列分析以鉴定其基因型别。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Invitrogen DNA 抽提试剂盒购自Invitrogen公司, TaKaRa EX Taq PCR扩增试剂盒购自大连宝生物公司,DNA 胶回收试剂盒购自Promega公司。

1.2 病例概况

男性,58岁,安徽肥东县高亮乡站马村农民,2011年11月11日因高烧39.5℃以上一周不退热进入安徽省立医院就诊。病人神志清醒，全身皮肤可见丘疹，呼吸粗重，颈部可见焦痂。给予头孢曲松治疗一周仍高烧不退，考虑可能是恙虫病，遂送血样至本中心予以检测。

1.3 病人血清恙虫病特异性抗体检测

检测总抗体的恙虫病胶体金诊断试剂为本中心研制,采用双抗原夹心法检测血样中抗东方体总抗体(Caoetal.,2007)。检测IgM和IgG的胶体金诊断试剂为本中心研制,采用间接法检测血样中的恙虫病特异性IgM 和IgG(Caoetal.,2007)。

1.4 病人血恙虫病东方体DNA 检测

1.4.1血样中DNA 的提取:采用Invitrogen DNA 抽提试剂盒，操作步骤参照说明书进行，0.5 mL 血样提取的DNA 溶于200 μL ddH2O,-20℃冰箱冻存备用。

1.4.2东方体56 kDa蛋白基因特异性引物： 根据恙虫病东方体标准株56 kDa蛋白基因序列(Stoveretal.,1990)设计引物，上游引物序列为东方体P56-F：5′-CTCCAGGATTTAGAG CAGAG-3′，下游引物序列为OTP56-R：5′-CTAGAAGTTATAGCGTAC-3′。

1.4.3PCR 扩增体系：PCR 扩增体系为50 μL，采用TaKaRa EX Taq试剂盒，体系中含10×EX buffer(Mg+)5 μL, EX Taq 1 U,dNTP mixture 4 μL,血DNA 2 μL，上下游引物各10 pmol,补ddH2O至50 μL。反应程序为95℃变性5 min；94℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72℃ 1 min，35次循环；72℃ 7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，成像系统记录电泳结果。

1.5 基因序列系统进化分析

用Promega胶回收试剂盒对目的片段进行回收纯化，送至南京英骏公司测序，将测序结果递交GenBank。同时将其登录NCBI 网站进行BLAST进行序列比对同源性分析。用Bioedit 软件将序列长度编辑一致并进行格式转换后, 用Clustal X 软件与各地东方体分离株、标准株序列(表1)进行多重排列、比较和同源性分析, 软件Mega 4.0 中Distances 程序计算一组序列内及组间基因进化距离(Evolutionary distances), 利用最短进化长度算法(Minimal evolution) 进行系统进化树分析。

表1 进化树分析所用的15个东方体株型及其56 kDa 蛋白基因的GenBank序列号Tab.1 The GenBank accession numbers of the 56 kDa protein genes of 15 strains of Orientia tustsugamshi used for phylogenetic tree analysis in this study

2 结果

2.1 血清学检测

采用恙虫病胶体金快速检测试剂对病人血清进行检测，结果抗东方体总抗体及抗东方体IgM和IgG检测线均出现红色条带(图1)，为阳性结果，表明病人存在东方体感染，并且为恙虫病现症病人。予以强力霉素对症治疗，病人迅速退热。

图1 病人血清中抗东方体抗体检测Fig.1 Detection of anti-O.tsutsugamushi antibodies in the serum of patient1:抗东方体总抗体检测; 2:抗东方体IgG和IgM检测.1:Detection of anti-O.tsutsugamushi total antibodies; 2: Detection of anti-O.tsutsugamushi IgG and IgM.

2.2 目的片段的扩增

以东方体合肥株血样基因组DNA为模板, 对目的基因进行PCR扩增, 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。PCR扩增产物与预测的目的基因分子量大小相符, 约1 320 bp。

图2 PCR扩增目的片段结果Fig.2 PCR amplification of the partial gene segment of O.tsutsugamushi 56 kDa proteinM: DNA 分子量标准；1：PCR 产物；2：阴性对照M: DNA marker;1: The PCR product of O.tsutsugamushi 56 kDa;2:Negative control.

2.3 生物信息学分析

将基因序列BLAST 显示,测得合肥株东方体56 kDa蛋白基因序列1 320 bp(JX976614)做BLAST序列比对，结果与昆明株和内蒙古株的序列一致性为100%。进化树分析显示该序列与昆明株和内蒙古株在同一分支，与标准株Kuroki的亲缘关系较近,共属同一分支，进化距离为0.015(图3)。

图3 15 株恙虫病东方体56 kDa基因序列构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of O. tsutsugamushi strains constructed based on nucleotide sequence of 56 kDaKarp, Gilliam, Kato, Kuroki, Kawasaki, Shimokoshi：标准株Standard strains of O. tsutsugamushi；Yonchon, Young worl：韩国分离株Strain from Korea；Ptan：中国平潭分离株Strain from Pingtan，China；Guangzhou中国广州分离株Strain from Guangzhou，China；Kunming：中国昆明分离株Strain from Kunming，China；Inner Mongolia：中国内蒙古分离株Strain from Inner Mongolia，China；Shandong：中国山东分离株Strain from Shandong，China；taiwan：中国台湾分离株Strain from Taiwan，China.

3 讨论

恙虫病广泛流行于亚洲太平洋沿岸地区，我国属于恙虫病重点疫区之一，疫区呈全国分布。安徽省近些年疫情频现。2007年三界地区驻军出现19例恙虫病病例(汪茂荣等,2008)；2008 年阜阳出现恙虫病暴发流行病例78 例(吴家兵等,2009)； 同年, 蚌埠也出现数十例恙虫病病例；2009年, 阜阳再次出现恙虫病暴发疫情(根据阜阳县疾控中心病例统计)，提示安徽省广泛存在恙虫病疫区。本次病例发生在安徽合肥市肥东县高亮乡站马村，该地之前从未有恙虫病病例报告,属合肥市范围内首次报告该病。病人发病前在家曾参加收割稻谷、稻草等农活。据该病人家属回顾忆当地与该病人一起劳作的另一同龄农民也出现相同症状，但未就医。病人发病近期无外出史，推测当地可能为恙虫病新疫区,但尚需进一步流行病学调查以证实疫源地存在。此次病例发生在11月初，为秋季型恙虫病，与既往安徽省报道恙虫病发病季节相同。

迄今, 世界各地已从患者、媒介昆虫及啮齿动物中分离到百余株恙虫病东方体(Daryletal.,2009)，我国各地恙虫病疫区已报道存在多种抗原型别的东方体(张萌等,2011)。东方体分型的传统方法是血清学方法，但随着分子生物学技术的发展，近年来，通过基因分型鉴定株型已得到广泛的应用。常用的方法是根据56 kDa型特异性蛋白基因分型, 所获得关于遗传多样性、东方体系统发育的信息，对于确定抗原异质性的宽幅以及建立特异诊断方法，制备有效疫苗分子具有重要作用(彭桂福等,2001； 陈香蕊等,1998)。

本研究从病人血中PCR扩增出1 320 bp东方体56 kDa外膜蛋白部分基因， BLAST显示该基因序列与昆明株和内蒙古株相似度高，达100%。进化树分析显示该序列与昆明株和内蒙古株在同一分支，与分离自日本的标准株Kuroki亲缘关系较近，进化距离为0.015。目前安徽省已鉴定的东方体型别有阜阳株Kawasaki型(图3)，安徽三界株的Young whorl型(本课题组待发表论文)，提示安徽省存在多种东方体抗原基因型别。