2012年中俄边境黑河口岸地区蜱携带病原体调查研究*

闻 静 赵 刚 焦 丹 王建华 王晓丹 王国政 时晓杰**

(1．黑河出入境检验检疫局，黑龙江黑河 164300；2. 黑龙江出入境检验检疫局漠河办事处，黑龙江漠河 165300)

蜱是携带及传播病原体较多的一种媒介生物，其携带的病原体大多数都可引起自然疫源性疾病和人兽共患病，如森林脑炎、莱姆病、立克次体病、土拉菌病等(高志华和刘敬泽, 2003)。近年来，一些新发或再度肆虐的蜱媒疾病对人畜的危害日趋严重，如嗜吞噬细胞无形体病、人巴贝西原虫病、新立克次体病等在局部地区流行(Sunetal.，2008；宋锋林等，2011)，引起了公共卫生部门的高度重视，黑河地区与俄罗斯接壤，是我国对俄罗斯贸易的重要口岸，也是一些蜱媒疾病如莱姆病(付维明等，2009)、立克次体病(孙秀峰等，2007)等蜱传疾病的疫区之一。加强对该地区的卫生监督、有效的诊断及溯源蜱传疾病对该区域的影响是预防国境口岸重要传染病发生及生物恐怖事件的基础。为此，本文于中俄边境黑河口岸地区采集蜱类，并开展蜱传病原体监测研究，为明确该地区的蜱媒病原本底，提升口岸检验检疫能力奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1蜱类采集：2012年4月16日至10月8日期间每个月分别在上旬及下旬进行两次蜱虫采集，采用布旗法在黑河、逊克、孙吴及漠河地区(表1)进行蜱虫采集，采集到731只蜱(森林革蜱Dermacentorsilvarum686只、嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna36只、全沟硬蜱Ixodespersulcatus9只)分成95组(除漠河的森林革蜱每组10只，全沟硬蜱每组9只其余均每组7～8只)进行病原体检测。

表1 蜱的采集地点及生境描述Tab.1 The description of the sample sites and habitat

1.1.2试剂：Taq酶、AMV反转录试剂盒、RNA提取试剂盒及基因组DNA提取试剂盒均购自Promega公司，大肠杆菌DH5α、dNTPs、DL2000 DNA marker、T载体均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1基因组提取：基因组DNA及总RNA的提取在生物安全柜内进行，每只蜱用75%酒精浸泡3～5 min，用无菌的双蒸水冲洗3次，7～8只一组分装在EP管内，利用组织破碎仪50/s振动破碎3 min，按照试剂盒说明书提取基因组DNA及RNA。

1.2.2PCR扩增检测：以提取的DNA为模板，按照表2列出的引物进行PCR扩增，用于检测伯氏螺旋体、嗜吞噬细胞无形体、立克次体(属)、土拉菌、巴贝西虫、查菲埃里克体。扩增反应体系包括Taq 酶1.25 U，10 ×PCR buffer 5 μL，dNTPs mixture 0.2 μmol/L，上下游引物0.5 μmol/L，模板DNA 约为0.5 μg，补充无菌水使总体积达到25 μL。94℃预变性5 min，然后按照表1列出扩增条件PCR循环，最后72℃延伸5 min。每检测组设一例阴性对照，反应体系同上，以DEPC处理过的水代替DNA模板。扩增到的片段经过胶回收后与 pMD-18T载体连接后送北京三博远志测序部进行测序。每组阳性率按照最小概率计算即一组阳性按照一只蜱携带病原体计算。

表2 实验所用引物及反应条件Tab.2 Experiments primer and reaction condition

TBEVr，TBEVf：森林脑炎病毒Tick borne encephalitis virus；CF1，CR2：伯氏疏螺旋体Borreliaburgdoferi；套式引物OUT-1 OUT-2， IN-1 IN-2: 嗜吞噬细胞无形体Anaplasmaphagocytophilum；PIRO-A, PIRO-B:巴贝西虫Babesia；Rsfg877, Rsfg1258:立克次体属Rickettsia；HME-1F, HME-3R: 查菲埃立克体Ehrlichiaechaffeensis；FtC1, FtC4: 土拉菌F．tularensis.

1.2.3RT-PCR检测：以提取的RNA为模板进行反转录，按照Promega反转录体系，加入1 μL RNA、dNTPs 0.4 μmol/L、1.25 U的RNase抑制剂、0.5 μg的random primer、1.5 U的AMV反转录酶，加入适量的水至20 μL进行反转录反应，反应条件为室温放置10 min，42℃保温1 h，之后95℃10 min后结束反应，反应完毕后将反应体系稀释至100 μL。取稀释后反转录产物1 μL进行PCR，用于检测森林脑炎病毒，每检测组设一例阴性对照，反应体系同PCR体系，以DEPC处理过的水代替DNA模板。按照表1列出的引物和扩增条件进行PCR扩增，反应体系同上。

2 结果

2.1 蜱类采集结果

本次采集共获得蜱类标本731只，经鉴定分属3属3种，其中森林革蜱D.silvarum686只占总体构成93.84%、全沟硬蜱I.persulcatus9只占总体构成1.23%、嗜群血蜱H.concinna36只占总体构成4.92%，具体数据及分布情况见表2及表3。

表3 蜱的种类及病原体检测情况Tab.3 Tick sampled and tick borne pathogen detected in Heihe area

2.2 蜱媒病原检测情况

采用8对引物对采集到的731只蜱分成95组进行PCR检测，阳性率按最小概率即每组一只阳性计算。结果发现仅在黑河市采集的标本中发现立克次体感染71例，最小阳性率为9.58%，随机抽取7个立克次体阳性样品，PCR扩增后目的条带经测序后与NCBI上的同源基因进行比对，发现与斑点群热群立克次体(Spotted fever group rickettsiae，SFGR)的劳氏立克次体Rickettsiaraoultii病原体相似率最高，初步认定为斑点热群立克次体(GenBank登录号: KC566999)。 Mediannikov等(2008)在与黑河毗邻的俄罗斯的哈巴罗夫斯克市的森林革蜱中检测出这种立克次体的菌株。森林脑炎病毒、伯氏螺旋体、嗜吞噬细胞无形体、查菲埃立克体、巴贝西虫及土拉菌病的检测结果均为阴性，具体的采集地点及生境描述见表1，采集蜱类及病原体检测情况见表3。

图1 立克次体(属)阳性样品PCR检测结果Fig.1 PCR detection for R. raoultii in D. silvarumM: DL2000marker; 1：阴性对照；2～7: 立克次体阳性样品. M: DL2000marker; 1：Negative control；2-7: Positive samples.

3 讨论

GPS及生境分析如表2所示，本文中大多数蜱来自黑河市黑呼公路7公路处，捕获的蜱类主要以森林革蜱为主，森林革蜱与嗜群血蜱的比例约为24∶1，生境主要以小灌木林草地为主的牧区；逊克县及孙吴县捕获的蜱种较单一分别是森林革蜱和嗜群血蜱，未发现其他蜱种；漠河县捕获的蜱数量较少但是全沟硬蜱的比例较高，全沟硬蜱与森林革蜱的比率几乎为1∶1。首先从数量上看，牧区及有田间作业的区域蜱类的数量较为繁盛，这与蜱类的生活习性息息相关；再次从蜱种构成上分析，纬度高的地区全沟硬蜱的数量更具优势，造成这种蜱种差异的原因较多，有可能与纬度及气候有关，也可能与当地的生态环境质量相关；从立克次体的感染率上看，只有黑河市存在着立克次体感染的情况，其他地区均未检出，但不排除其他地区存在着蜱传疾病病原体感染的情况，病原体的检出率与检测样本数量的大小有密切关系，由于除黑河市以外其他地区采集到蜱类数量较少，可能影响了整体检出率。

立克次体是一类严格的活细胞内寄生的原核细胞微生物，在自然界的许多脊椎动物中广泛分布，蜱类是其重要的传播媒介。在我国，从北向南，从东到西，以及中原地带，都存在斑点热群立克次体的感染。黑龙江是斑点热群立克次体的主要疫区(刘国平等，2008)，孙秀峰等(2007)曾对黑龙江中俄口岸的立克次体情况进行了调查，发现大部分感染样品属北亚蜱传伤寒立克次体R.sibirica感染，只有少数为R.heilongjiangensis和R.hulinii感染。Rickettsiaraoultii曾在欧洲的边缘革蜱D.marginatus中发现，本文发现R.raoultii在森林革蜱中的存在，这和我国西藏地区报道的西藏革蜱D.everestianus和银盾革蜱D.niveus(现更名为塔吉克斯坦革蜱D.daghestanicus)中发现的R.raoultii具有一定的相似性(Wangetal., 2012)，但由于自然地理条件和海拔的差异，R.raoultii的致病性和传播特征是否存在差异有待进一步研究。

本研究对中国与俄罗斯边境黑河口岸地区2012年采集到的731只蜱携带的病原体进行检测。从蜱种构成来看，森林革蜱是黑河地区的优势蜱种占总体构成的93.8%，其次是嗜群血蜱，再次是全沟硬蜱。杨丽炜等(2009)曾经对黑龙江口岸蜱类携带病原体进行了调查，其中黑河口岸蜱类埃立克体感染率为4.48%，莱姆病的感染率为2.25%及斑点热立克次体感染率为0.90%；国内学者曾从中俄口岸地区的全沟硬蜱中分离出了巴贝西虫病原体证明了我国中俄边境地区蜱中存在微小巴贝西原虫的自然感染源(Sunetal.，2008；付维明，2010)。在本调查中并未发现有莱姆病、巴贝西虫及埃立克体病原体，这种调查结果的差异可能与地区蜱种构成密切相关，付维明等(2009)在对中俄口岸各蜱种调查发现全沟硬蜱的带菌率均较高，达到21.7%，森林革蜱和嗜群血蜱的带菌率较低，平均为2.4%和3.3%。本实验中全沟硬蜱只占1.23%，携带病原体较低的蜱种森林革蜱数量占93.84%。何浩等(2008)对黑河地区蜱传疾病调查时并没有发现莱姆病螺旋体、巴贝西虫及埃立克体阳性样本，与本研究结果一致，除莱姆病、埃立克体、立克次体及巴贝西虫外，黑河口岸还未有发现其他蜱媒病原体的报道。