环媒恒温扩增(LAMP)技术在寄生虫检测中的应用*

童群波 陆绍红

(浙江省医学科学院寄生虫病研究所，杭州 310013)

寄生虫病的危害仍是普遍存在的公共卫生问题，在发展中国家，特别在热带和亚热带地区，寄生虫病依然广泛流行,威胁着无数儿童和成人的健康甚至生命。联合国开发计划署/世界银行/世界卫生组织联合倡议的热带病特别规划要求防治的6类主要热带病中，除麻风病外，其余5类都是寄生虫病，即疟疾(Malaria)、血吸虫病(Schistosomiasis)、丝虫病(Filariasis)、利什曼病(Leishmaniasis)和锥虫病(Trypanosomiasis)。临床上对寄生虫病的检测经历了病原学诊断和免疫学诊断后，分子生物学诊断方法也日益发展，特别是PCR技术作为一种高效的核酸扩增技术在寄生虫病检测方面发挥了重大作用，但是PCR操作必须有高精密的热循环仪器和凝胶成像仪，使其在基层和现场开展受到严重制约。Notomi等(2000)首先提出一种全新的核酸扩增技术——环媒恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术，它是一种快速、简单、灵敏、特异的核酸扩增方法,针对靶基因的6个独立区域设计4条特异引物，FIP, BIP, F3 和B3(图1)，在链置换DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下高效扩增靶基因。首先，内引物FIP与模板F2c 结合，在 Bst DNA聚合酶的作用下启动链DNA合成，外引物F3与模板F3c 结合并合成与模板DNA互补的单链，同时置换出FIP引物合成的DNA链。BIP与置换链DNA杂交，开始新链的合成。然后B3引导合成FIP引物合成链的互补链，置换释放BIP引物合成链，被置换的单链DNA均存在互补序列，发生自我碱基配对，两端各自形成茎环结构，该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合，开始新一轮的链置换合成，周而复始，形成高效率的扩增，扩增的最后产物为大量长短不一的DNA链。其特点包括：(1) 不需要昂贵的PCR仪等设备，只需恒温装置，如水浴锅；(2)扩增效率高，在水浴恒温(60～65℃),反应3O～60 min可使低拷贝数的DNA扩增达109水平；(3)结果判断简单，LAMP技术在核酸合成过程中，从脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，产生大量白色焦磷酸镁沉淀，因此，可以通过浑浊度直接肉眼观察，或者通过反应前加入钙黄绿素来观察颜色的变化，也可以通过浊度仪实时监测，无需电泳。作为一种新的核酸扩增方法，LAMP被逐渐应用于寄生虫、病毒、微生物的检测,在疾病的快速检测方面发展迅速，是最有发展前景的快速诊断方法之一，现将LAMP技术在寄生虫检测方面的应用综述如下。

图1 环媒恒温扩增(LAMP)技术引物设计Fig.1 Primer design for Loop-mediated isothermal amplication

1 蠕虫

1.1 吸虫

1.1.1日本血吸虫Schistosomajaponicum：杨秋林等(2008)开展了应用LAMP技术检测日本血吸虫尾蚴的实验研究,设计4条扩增尾蚴钙结合蛋白基因的LAMP引物，进行LAMP反应，LAMP可检测到尾蚴的最低数量为1条。Xu等(2010)针对日本血吸虫高度重复的转座子SjR2基因序列设计引物，DNA最小检测量达到 0.08 fg，敏感性是传统PCR的104，能够检测感染血吸虫尾蚴1周后的兔血清。经吡喹酮治疗，12周后无法检测到血清中的日本血吸虫基因组DNA。Wang等(2011)同样根据SjR2设计引物，LAMP方法能检测出感染1周后兔血清中的血吸虫DNA，而传统的PCR方法需要在感染2周后才能检测到。分别进行青蒿琥酯和吡喹酮治疗后检测不到血清中的DNA。这些结果表明LAMP方法对于血吸虫感染的早期诊断及评价药物的疗效是有效的。Kumagai等(2010)建立了基于28S核糖体(Sj28S)的LAMP方法，设计的引物特异性良好，与曼氏血吸虫S.mansoni无交叉反应。用PCR和LAMP法平行检测日本血吸虫感染的钉螺，结果发现LAMP法与PCR法检测的灵敏度同样，最低检测限度为100 fg，能够检测出钉螺Oncomelaniahupensis感染1个毛蚴1 d后的血吸虫DNA。同时群体检测结果显示LAMP能扩增1个感染的钉螺混合100个阴性钉螺的混合样本中的血吸虫DNA，因此可应用LAMP方法进行现场样本的群体检测，从而预测流行区的感染风险。

1.2 绦虫

1.2.1细粒棘球绦虫Echinococcusgranulosus：徐祥珍等(2011)根据囊型棘球蚴病病原细粒棘球绦虫线粒体12S rRNA序列的保守区域，设计4条LAMP反应引物，用LAMP技术检测我国较为流行的细粒棘球绦虫DNA，以家犬体内常见的泡状带绦虫TaeniahydatigenaDNA为对照，评价该技术检测棘球蚴病的特异性。结果显示该引物与泡状带绦虫不发生交叉反应，具有良好的特异性；同时，对不同稀释度细粒棘球绦虫虫卵进行检测，发现能检测到含1个虫卵的DNA样本，提示该法具有较高的敏感性。因此，LAMP技术有望成为检测棘球蚴病病原感染的新方法，并可用于终宿主棘球绦虫感染的常规监测。

1.2.2带绦虫Taenia：Nkouawa等(2009)根据绦虫组织蛋白酶样半胱氨酸肽酶(clp)和细胞色素c氧化酶亚基1(Cox1)基因设计LAMP引物，建立检测带绦虫的LAMP方法。其中根据Cox1基因建立的LAMP方法可以区分3个种，而根据clp基因建立的LAMP可以区分有钩绦虫T.solium和无钩绦虫T.saginata或亚洲带绦虫T.asiatica，通过限制性酶消化LAMP产物又可区分无钩绦虫和亚洲带绦虫。随后，Nkouawa等(2012)应用这个方法鉴别人携带的带绦虫的亚种。从35个带虫者中分离到51个节片，LAMP鉴定结果显示有9个为猪带绦虫Taeniasolium，1个为亚洲带绦虫T.asiatica，另外41个为牛带绦虫T.saginata，结果显示LAMP方法能够用于带绦虫的快速鉴别，有助于带绦虫病的预防和控制。

1.3 线虫

1.3.1广州管圆线虫Angiostrongyluscantonensis：Chen等(2011)建立了基于广州管圆线虫18s rRNA的LAMP方法，最低能检测到1 fg的基因组DNA，比PCR方法敏感。另外还进行了交叉反应性研究，此方法与刚地弓形虫Toxoplasmagondii、恶性疟原虫Plasmodiumfalciparum、日本血吸虫S.japonicum华支睾吸虫Clonorchissinensis、卫氏肺吸虫Paragonimuswestermani和异尖线虫Anisakis均无交叉反应。用此LAMP方法检测人工感染广州管圆线虫35 d后的福寿螺Pomaceacanaliculatasnails，均为阳性，说明对于福寿螺体内广州管圆线虫的检测是有效的。Liu等(2011)建立了一种特异性的LAMP方法检测褐云玛瑙螺Achatinafulica内广州管圆线虫DNA，引物基于rDNA的第一转录间隔区(The first internal transcribed spacer，ITS-1)，与简单异尖线虫Anisakissimplexs.s, 毛首扁形线虫Trichuristrichiura，犬弓蛔虫Toxocaracanis，旋毛虫Trichinellaspiralis及人蛔虫Ascarislumbricoides均无交叉反应，比传统的PCR方法相敏感10倍，最低检出DNA达到0.01 ng/μL。为了评价此方法的应用价值，从流行区收集检测了45个褐云玛瑙螺，PCR方法检出率为46.7%(21/45)，而LAMP方法为51.1%(23/45)，提示LAMP方法比传统PCR方法更敏感。

1.3.2异尖线虫Anisakis：郑洋妹等(2010)根据简单异尖线虫Anisakissimplexs.sITS保守区域序列设计特异性引物，建立了快速鉴定该虫的LAMP方法。对10倍比稀释的简单异尖线虫ITS序列重组质粒进行灵敏性试验,灵敏度达到10拷贝/μL；用典型异尖线虫Anisakistypica、对盲囊线虫Contracaecumsp.、针蛔线虫Raphidascaristrichiuri作为对照进行特异性试验，无交叉反应；应用建立的LAMP方法检测7份经PCR—RFLP鉴定为简单异尖线虫的样品，结果均为阳性，显示建立的LAMP方法灵敏性高、特异性强，是检测简单异尖线虫的有效手段。

2 原虫

2.1 疟原虫Plasmodium

疟疾是世界上危害最严重的寄生虫病之一，人体疟原虫主要有恶性疟原虫Plasmodiumfalciparum、间日疟原虫P.vivax、三日疟原虫P.malariae和卵形疟原虫P.ovale4种。近年来建立了以18S rRNA为检测靶标的可鉴别这四种疟原虫的LAMP方法(Poonetal., 2006; Hanetal., 2007; Parisetal., 2007; Yamamuraetal., 2009)。Han等(2007)根据人疟原虫18S rRNA建立LAMP方法，对4种疟原虫进行了临床诊断，并与显微镜检和巢式PCR进行对比。结果表明，对于三日疟原虫、卵形疟原虫，LAMP检测18S rDNA的最低检出限为1O个拷贝。而对于恶性疟原虫和间日疟原虫检出限为100个拷贝。其检出准确性与巢式PCR完全相符，但相比巢式PCR耗时更短，不需要复杂的过程，只需热处理过的血样即可作为模板，4种疟原虫均可在40 min内完成LAMP检测。LAMP实验简单可靠，既可用于疟疾流行区监测，也可用于实验室诊断。Sirichaisinthop等(2011)把上述LAMP方法应用于现场诊断，同时与镜检方法比较。110份血液样品中60份镜检阳性的样品检出59份为阳性(敏感性98.3%)，50份镜检阴性的样品全部为阴性(特异性100%)。LAMP的阴性预测值和阳性预测值分别为98%和100%，表明LAMP方法是现场诊断疟疾的有效工具。Lu等(2012)用LAMP方法、巢式PCR和镜检方法诊断间日疟。164例采自我国中部疟疾流行区的镜检阳性样本中，LAMP方法检出160例间日疟原虫，敏感性为97.6%，而巢式PCR检出162例，敏感性为98.8%，LAMP方法简便易行，表明LAMP方法在疟疾流行区诊断间日疟是可行的。陈勤等(2011)利用此LAMP方法对采自云南、海南省的恶性疟患者血样进行疟原虫检测，并与镜检和巢式PCR结果作比较，评估其检测疫区恶性疟患者血中疟原虫的特异性和敏感性。共检测78份恶性疟患者和3O份健康人血样，其中72份患者血样LAMP检测为阳性，以镜检法为金标准，LAMP筛检的灵敏度为92.3%、特异性为100%，阳性预测值和阴性预测值分别为100%和83.3%；以巢式PCR为参考，LAMP筛检的灵敏度为97.2%，特异性为94.4%，显示LAMP方法检测恶性疟原虫的敏感度和特异性与巢式PCR方法相近，可应用于现场恶性疟原虫的检测。

2.2 弓形虫Toxoplasma gondii

Kong等(2012)根据529 bp重复序列设计引物，建立了一种新的LAMP方法，反应在65℃下进行1 h，弓形虫基因组DNA的最低检测量为0.6 fg，比基于B1基因的LAMP和基于 529 bp重复序列的巢式PCR检出敏感性分别高100和1 000倍，而且与伊氏锥虫Trypanosomaevansi、恶性疟原虫P.falciparum、日本血吸虫S.japonicum、卫氏并殖吸虫Paragonimuswestermani、肝片吸虫Fasciolahepatica和广州管圆线虫A.cantonensis的DNA无交叉反应性。用此LAMP方法能检测感染刚地弓形虫RH株速殖子1 d后的小鼠血样,首次报道了LAMP能用于实验室感染小鼠的弓形虫早期诊断。陈道桢等(2011)选用构建的弓形虫Bl基因质粒为阳性模板，建立LAMP检测弓形虫的方法，并进行特异性和敏感性评估，在此基础上建立LAMP检测弓形虫的定量体系及通过显色反应直接判断结果的简便方法，最后应用建立的方法对57例孕妇外周血标本进行了检测，因此有望在临床检测中发挥一定的作用。Krasteva等(2009)选取刚地弓形虫的SAG1基因设计引物，LAMP实验与传统PCR的实验结果相符。

2.3 锥虫Trypanosoma

I型布氏冈比亚锥虫Trypanosomabruceigambiense是引起非洲锥虫病(Human African trypanosomiasis，HAT)的主要致病原，冈比亚HAT精确诊断始终缺乏有效的方法，Njiru等(2008)根据涎传锥虫亚属的重复插入活动因子(Repetitive insertion mobile element, RIME)建立了LAMP方法，只需25 min即可做出鉴定。Njiru等(2011)采用冈比亚锥虫特异的糖蛋白基因 (TgsGP)为模板，敏感性相当于能检测10 个锥虫/mL提取DNA或煮沸血液上清中1个锥虫/mL，而传统PCR的敏感性大约在10～1 000个锥虫/mL。

2.4 隐孢子虫Cryptosporidium

隐孢子虫是一种危害严重的人兽共患、机会致病性病原，它们感染免疫功能正常的宿主后并不引起严重临床症状，当机体抵抗能力下降或免疫功能不全时，其繁殖能力和致病能力增强，患者出现明显的临床症状和体征，甚至危及生命。Bakheit等(2008)从南非的牛、绵羊和马的粪便中提取隐孢子虫DNA，根据隐孢子虫18S rRNA序列，用巢式PCR方法检测全部为阴性，而用LAMP方法检测有1/3以上的样本为阳性。研究表明LAMP技术比巢式PCR更敏感。袁忠英等(2009)用环介导等温扩增技术检测牛粪中提取的隐孢子虫卵囊DNA，根据隐孢子虫18S rRNA序列设计4对隐孢子虫特异引物，利用LAMP检测牛粪中隐孢子虫卵囊DNA和蓝氏贾第鞭毛虫GiardialambliaDNA，以正常牛粪DNA为阴性对照。结果隐孢子虫卵囊DNA为阳性，蓝氏贾第鞭毛虫DNA为阴性，具有良好的特异性。

2.5 蓝氏贾第鞭毛虫Giardia lamblia

蓝氏贾第鞭毛虫是一种重要的人兽共患寄生原虫，分布于全世界，由该寄生虫感染引发的腹泻可在人和动物之间通过水源、食物等途径广泛传播，引起暴发流行。Plutzer等(2009)利用LAMP技术对35份样品进行检测，其中阳性24份，常规PCR检测23份阳性；利用LAMP法成功地扩增了0.548 pg贾第鞭毛虫集聚体B的DNA和0.8 pg贾第鞭毛虫集聚体A的DNA；特异性实验显示LAMP法只能扩增贾第鞭毛虫集聚体A和B，其他寄生虫均不能扩增。卢维媛等(2010)利用体外培养蓝氏贾第鞭毛虫滋养体，提取DNA，建立LAMP技术检测蓝氏贾第鞭毛虫的方法, 结果显示蓝氏贾第鞭毛虫为阳性，与安氏隐孢子虫DNA、恶性疟原虫DNA无交叉反应性。

2.6 巴贝西虫 Babesia

巴贝西虫是一类血液寄生型原生动物，经蜱传播，主要侵染犬、牛、马类等脊椎动物，患病动物主要表现为发热、黄疸、贫血等症，近年来，在人类中也发现巴贝西虫病的存在。Guan等(2008)设计了2对分别针对巴贝西临潭株Babesiasp.BQ1(Lintan)和巴贝西新疆株Babesiasp. Xinjiang 18S rRNA的LAMP引物，用来检测感染的羊血和纯化的巴贝西虫提取的DNA。对于巴贝西临潭株和巴贝西新疆株的最小检测量分别为0.02 pg和0.2 pg。 365份从甘肃采集的感染巴贝西虫的绵羊血，其中14.3%(52/365)LAMP检测为阳性。145份从新疆放牧的绵羊采集的样品中，3.5%(5/145)LAMP检测为阳性，结果表明LAMP方法能作为巴贝西虫感染的新的检测方法。Liu等(2012)设计了2对分别针对牛巴贝西虫B.bovis和双芽巴贝西虫B.bigemina转录间隔区(Internal transcribed spacer，ITS)的引物，最小检测量都达到0.1 pg，优于传统的PCR方法。这个方法已经在实验室感染的牛血样本和现场的牛血样本进行了验证评估。因此对于巴贝西虫流行的国家，LAMP方法在流行病学调查和临床诊断方面有潜在的应用价值。

3 结语

作为一种新的核酸扩增方法，LAMP已被逐渐应用于病原的分子检测。LAMP技术在实际应用中还存在一些问题：(1)筛选特异性靶标和设计引物是LAMP技术的关键，有些疾病的靶基因无法设计合适的引物，可能不适合LAMP方法；(2)LAMP方法的扩增效率很高，在反应过程中有大量的核酸合成，一旦开盖容易形成气溶胶污染，加上目前国内大多数实验室不能严格分区，容易导致污染和出现反应假阳性；(3)LAMP试剂相对于PCR试剂价格较贵。相信在未来的研究中LAMP将得到更多的改进和完善，在寄生虫病的快速分子检测中发挥更大的作用。