吉林地区山羊中泰勒虫感染检测及其序列分析*

张 圆 江佳富詹 琳孙 毅曹务春**

(1.中南大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，长沙 410078；2.军事医学科学院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071)

泰勒虫病是由泰勒科(Theileriidae)泰勒属Theileria原虫引起经蜱传播的一种疾病,可以侵袭马、牛、羊、鹿、骆驼、和其他野生动物的网状内皮系统细胞和红细胞(Schnittgeretal., 2003)。目前羊致病种类国外报道主要有莱氏泰勒虫T.lestoquardi、绵羊泰勒虫T.ovis、隐藏泰勒虫T.recondita和分离泰勒虫T.separata等(Alanietal., 1988; Yinetal., 2007)，在我国主要是吕氏泰勒虫T.luwenshuni、尤氏泰勒虫T.uilenbergi和绵羊泰勒虫T.ovis等。我国羊泰勒虫病最早于1958年在四川发现，随后在青海、甘肃、辽宁、内蒙古、陕西、河北、宁夏、新疆等地均有本病的报道(郭淑珍等，2003;高玉龙等，2005)。我国东北吉林地区也是重要的畜牧区，该地区也已有羊泰勒虫病的报道(田万年等，2008a)，并通过相对保守区的短基因片段(459 bp)的检测认为是青海羊中分离株Theileriaspp. China 1型，没有准确定种。另外，由于该地区地形地貌较为多样，媒介蜱种类多，是否还有其他型别的泰勒虫感染也是一个关注的问题。为此，基于泰勒虫对该地区养羊业的严重威胁,为采取更加有针对性地有效措施，我们在吉林珲春地区采集山羊血液，利用泰勒虫18S rRNA 基因序列，采用PCR方法了解吉林省山羊中泰勒虫的感染情况，初步确定该地区羊泰勒虫的优势虫株，为该地区羊泰勒虫病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

2009年5月份，在吉林省珲春市与俄罗斯、朝鲜毗邻的敬信地区山羊泰勒虫流行地点采集山羊血液，每份5 mL至EDTA抗凝管中，-20 ℃保存，送至军事医学科学院微生物流行病研究所待测。

1.2 DNA提取

每份血液样本取200 μL，使用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒(天根公司)，按照说明书操作提取DNA，-20 ℃保存，备用。

1.3 引物设计

根据GenBank中注册的Theileriaspp.18S rRNA全长基因序列，采用Primer 5.0软件，设计两对引物，进行全长分段扩增。上半段引物为Bvi-fshang和Bvip-r，下半段引物为Bvip-f和Bvi-r2(表1)，分别扩增泰勒虫约700、900 bp片段，拼接后得到全长。

表1 本研究检测泰勒虫所用引物Tab.1 Primers used to detect Theileria spp. in this study

1.4 PCR

采用TaKaRa公司Premix TaqTM试剂和dNTP Mixture试剂，并按说明书操作，上半段扩增体系总体积为20 μL，包括DNA 2 μL、10×PCR缓冲液2 μL、浓度为2.5 mmol/L的dNTP Mixture 0.8 μL、Taq DNA聚合酶1 U、浓度为10 μmol/L的引物Bvi-fshang和Bvip-r各0.4 μL，水14.2 μL。反应条件94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸50 s，40个循环；72 ℃后延伸7 min。下半段扩增引物用Bvip-f和Bvi-r2，反应体系和反应条件与上半段相同。本次实验用水做阴性对照。取PCR产物5 μL，于1.2%含EB的琼脂糖凝胶中电泳观察结果。

1.5 测序与序列分析

将PCR扩增阳性核酸片段，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根公司)进行切胶纯化后，送天一辉远生物技术公司进行序列测定，双向测通并应用NCBI提供的BLAST程序进行比对，用MEGA 5.0软件进行序列合并及做系统发育分析。

2 结果

共采集到70只山羊的血液，通过PCR检测，其中有51份用引物Bvi-fshang和Bvip-r及引物Bvip-f 和Bvi-r2均扩增出清晰的目的条带，长度近700、900 bp，大小符合预测值(图1)，感染率为72.9%。

图1 山羊血液标本中泰勒虫PCR扩增产物电泳图Fig.1 Amplification 18S rRNA of Theileria spp. in goat1: 山羊2号Bvi-fshang和Bvip-r扩增产物；2: 山羊6号Bvi-fshang和Bvip-r扩增产物；3: 空白对照Bvi-fshang和Bvip-r；4: DNA分子量标准DL2000；5. 山羊2号Bvi-f和Bvip-r2扩增产物；6. 山羊6号Bvi-f和Bvip-r2扩增产物；7. 空白对照Bvi-f和Bvip-r2.1：Goat 2 by Bvi-fshang and Bvip-r;2：Goat 6 by Bvi-fshang and Bvip-r; 3: Negative control of DDW by Bvi-fshang and Bvip-r; 4: Maker DL2000; 5:Goat 2 by Bvi-f and Bvip-r2;6: Goat 6 by Bvi-f and Bvip-r2; 7: Negative control of DDW by Bvi-f and Bvip-r2.

从51份阳性样本中随机抽取9份PCR产物进行测序，并用Mega 5.0进行序列拼接，获得1 596 bp基因序列，将其递交NCBI网站获得序列号KC429038，与GenBank中已注册的基因序列经Blast对比显示：与吕氏泰勒虫全长T.luwenshuni(JX469518)最接近，仅存在一个碱基差异；与从中国青海省羊标本中检测到的泰勒虫Theileriaspp. China 1(AY262119)有5个碱基差异；与绵羊泰勒虫T.ovis(FJ603460)同源性为97%；与尤氏泰勒虫T.uilenbergi(JF719835)同源性为96%。将吉林报道的459 bp序列Theileriaspp.18S-Jilin(没有在GenBank注册，仅在文中列出)经过分段比对，结果发现与本研究得到的序列、Theileriaspp. China 1以及吕氏泰勒虫相对应的位置没有任何差异。而与上述其他种类差异较大，为25～30个碱基。

图2 基于泰勒虫18S rRNA序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic trees were performed based on 1 600 bp of 18S rRNA genes of Theileria spp.前加“*”为本研究所获序列。The sample in present study has noted with asterisk “*”.

将合并后的1 596 bp序列与GenBank中的18S rRNA核苷酸序列进行同源性比较并用NJ法(bootstrap=1 000)构建系统发育树。从图2中可以看出，阳性样本序列与吕氏泰勒虫T.luwenshuni位于同一小分支(图2)。

3 讨论

自1958年在我国四川报道羊泰勒虫病后，本病在青海、甘肃、辽宁、内蒙古、陕西、河北、宁夏、新疆等地均有陆续报道。另外，我国东北吉林地区也是重要的畜牧区，有文献报道该地区羊泰勒虫病的感染率为29.23%(田万年等，2008a)。然而，在本次研究中，吉林省山羊泰勒虫的感染率为72.9%，远远高于之前报道的阳性率。说明本病在该地区已对养羊业构成严重威胁,相关部门应予以重视，采取有效措施以控制该病的进一步蔓延。之前，有研究者通过459 bp基因片段检测确认东北吉林地区羊泰勒虫分离株为Theileriaspp. China 1型(田万年等，2008b)，没有准确定种。此次我们应用PCR方法获得近1600 bp左右，经序列分析与吕氏泰勒虫最接近，仅相差一个碱基。深入比较分析吉林报道的459 bp序列Theileriaspp.18S-Jilin，发现其与本研究得到的序列、Theileriaspp. China 1以及吕氏泰勒虫相对应的位置没有任何差异，说明这三个来源标本的泰勒虫在这个基因区段相对保守，不足以区分Theileriaspp. China 1以及吕氏泰勒虫，根据459 bp基因把吉林流行株确认为与羊泰勒虫China 1 株100%同源性，值得商榷，很可能，这一株还是吕氏泰勒虫虫株。结合本研究中羊泰勒虫的感染率(72.9%)和用18SrRNA基因扩增出的山羊血液中泰勒虫基因型为吕氏泰勒虫，可以初步说明，在该地区在引起羊泰勒虫病的优势虫株为吕氏泰勒虫，且普遍存在。对于功能基因、血清学方面以及泰勒虫形态学方面的证据，我们会在以后的实验中进行。

有文献报道在可以感染羊的泰勒虫中，莱氏泰勒虫和尤氏泰勒虫致病力最强，吕氏泰勒虫次之，绵羊泰勒虫、隐藏泰勒虫和分离泰勒虫致病性很弱或无致病性(Alanietal., 1988; Yinetal., 2007)。此次在山羊中检测到的为吕氏泰勒虫，虽然没有表现出典型的临床症状，但足以引起我们对预防和控制该地区山羊中泰勒虫病的高度重视。