甲泼尼龙减轻水通道蛋白4抗体对星形胶质细胞和神经元的毒性

张洁 刘亚坤 王彦永 任士卿

视神经脊髓炎（NMO）是一种主要侵犯视神经和脊髓的中枢神经系统炎性脱髓鞘性疾病。随着对其特异性自身抗体即水通道蛋白4（aquaporin－4，AQP4）抗体研究的进展，发现其不仅是NMO鉴别多发性硬化（MS）的特异标志物，而且在NMO发病机制中发挥重要的作用。AQP4抗体和中枢神经系统血－脑脊液屏障周围星形胶质细胞足突上的AQP4结合激活补体，对星形胶质细胞产生补体依赖性细胞毒性作用，破坏血－脑脊液屏障和内环境稳定性，导致NMO的发生［1］。目前大剂量甲泼尼龙是治疗急性NMO的首选方法，但缺乏循证医学的证据。临床研究仅见小样本病例报道，认为甲泼尼龙可能通过免疫抑制作用、抗炎、减轻细胞水肿等发挥其治疗作用［2］，有关其对AQP4抗体诱导的大鼠大脑皮质神经细胞毒性作用的研究尚未见报道。本实验观察AQP4阳性血清对体外培养大鼠脑皮质星形胶质细胞和神经元的毒性作用，以及甲泼尼龙预处理对星形胶质细胞和神经元的影响，旨在为临床治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂:细胞培养基（DMEM，购自GIBCO公司）、胎牛血清（四季青公司）、多聚甲醛（天津市永大化学试剂开发中心）、Hoechst33258（Sigma公司）、抗微管相关蛋白－2（MAP－2，购自Sigma公司）、抗神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP，购自NeoMarkers）、异硫氰酸荧光素（FITC，购自Sigma公司）、甲波尼龙（购自Pfizer公司）。

1.1.2 AQP4阳性血清:收集作者医院就诊的NMO患者3例，NMO诊断采用 Wingerchuck诊断标准［3］。AQP4抗体测定采用细胞间接免疫荧光分析法，其AQP4抗体滴度分别为1∶10、1∶320和1∶1000，作为抗体阳性组；5名健康体检者血清作为对照组。所有血清抗可溶性抗原（ENA）抗体检测阴性。均取晨空腹静脉血，高速离心机离心（800 g）3min，血清置－80℃冰箱备用。本研究得到作者医院伦理委员会批准通过。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠皮质细胞培养:选取出生48h以内的Wistar大鼠新生鼠6只，于无菌状态下取出双侧大脑皮质，剥离脑膜后，将剪碎的皮质组织用0.25%（质量浓度）胰蛋白酶消化20min，加入20%（体积分数）胎牛血清的DMEM培养液终止消化，用火焰抛光的玻璃吸管反复吹打，制备成单细胞悬液，以50 g离心5min，去除上清，加入3～4mL培养液，再次吸管吹打后细胞筛过滤，将细胞接种到多聚赖氨酸包被的6孔板中，置5%（体积分数）CO2的37℃恒温培养箱中培养。48h后换液，培养4d的细胞用于实验。

1.2.2 实验分组:原代大鼠皮质细胞培养4d后随机分为6组:（1）对照组:按10%体积比例加入对照组血清；（2）不同AQP4抗体阳性血清组:按10%体积比例分别加入1∶10、1∶320和1∶1000滴度的AQP4抗体阳性血清，共3个亚组；（3）单独甲泼尼龙组:预先4h加入0.8μmol／mL甲泼尼龙10μL，随后按10%体积加入对照组血清；（4）甲泼尼龙＋1∶1000血清组:预先加入0.8μmol／mL甲泼尼龙10μL，4h后按10%体积比例加入1∶1000滴度AQP4抗体阳性血清。细胞继续培养6h后对培养细胞固定并行细胞免疫荧光染色。各组均重复测定3次。

1.2.3 免疫荧光染色:将准备行免疫荧光染色的细胞用0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3次；以4%（质量浓度）多聚甲醛室温下固定30min；含0.3%（体积分数）Triton X－100的5%（体积分数）山羊血清室温下与细胞作用45～60min；加入兔抗 MAP－2（1∶100）或兔抗GFAP（1∶200）与细胞共同孵育，4℃过夜；加入FITC－羊抗兔IgG（1∶100）或FITC－羊抗鼠IgG（1∶100），37℃孵育45 min；为明确各种神经细胞总数，Hoechst33258（10 μg／mL）复染胞核；每步骤间均经0.01mol／L PBS漂洗3次，每次5min。最后置于Nikon倒置荧光显微镜下观察星形胶质细胞和神经元形态和数目，CCD（Nikon Digital Camera DXM－1200F）采样。每次行免疫荧光染色时，均设一张阴性对照，即一抗由PBS代替，其余染色过程相同。

1.2.4 细胞计数方法:在倒置荧光显微镜下随机选择10个不同的视野，使用NIS－Elements BR 3.0软件采样，应用Image Pro－Plus软件进行计数MAP－2阳性神经元数和GFAP阳性星形胶质细胞的细胞数，并通过计数Hochest33258标记明确细胞总数，然后计算不同神经细胞所占的比例。为保证采集图像的质量，每次实验均根据阴性对照结果调节曝光时间。各组实验独立重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件统计学处理，数据以均数±标准差表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AQP4抗体阳性血清对原代培养鼠大脑皮层细胞形态的影响 对照组细胞外形清晰，突起粗壮；加入各种滴度的AQP4抗体阳性血清6h后均可见星形胶质细胞肿胀，突起减少、缩短及断裂。神经元细胞也出现突起减少、断裂、长度不完整表现。单独甲波尼龙处理组并不引起明显星形胶质细胞和神经元形态的变化，而甲波尼龙＋1∶1000血清组能明显减少这种形态改变，细胞损伤程度明显减轻（图1）。

图1 大鼠大脑皮质细胞培养MAP－2和GFAP免疫荧光染色结果（×200）

2.2 AQP4抗体阳性血清对原代培养大鼠皮质星形胶质细胞和神经元的影响 对照组、1∶10、1∶320和1∶1000滴度血清处理组星形胶质细胞比例分别为（52.22±3.75）%、（45.83±4.82）%、（35.77±5.91）%和（24.68±3.40）%；神经元比例分别 为 （44.93±2.39）%、（39.00±4.33）%、（32.21±2.67）%和（23.35±2.65）%。各组间其星形胶质细胞比例和神经元比例有统计学差异（F值分别为48.09和71.41，均P＜0.01），组间两两比较均有统计学差异（均P＜0.01）。

2.3 甲波尼龙对大鼠皮质细胞数量的影响 单独甲波尼龙组和甲泼尼龙＋1∶1000血清组星形胶质细胞比例分别为（44.52±3.71）%和（43.29±3.80）%；神经元比例分别为（43.10±5.56）%和（42.11±5.94）%。与1∶1000滴度血清组比较，甲泼尼龙＋1∶1000血清组星形胶质细胞和神经元数目明显增多（均P＜0.01）。单独甲波尼龙组星形胶质细胞数目较对照组明显减少（P＜0.01），而对神经元数目无影响（P＞0.05）。

3 讨论

AQP4是中枢神经系统主要的水通道蛋白，主要分布在中枢神经系统微血管周围星形胶质细胞的足突、神经胶质界膜和室管膜上［4］。体外单纯星形胶质细胞培养研究表明AQP4抗体和星形胶质细胞表面的AQP4结合，并激活补体通路以补体依赖形式导致星形胶质细胞死亡［5］。AQP4转染细胞吸附AQP4抗体能减少AQP4抗体滴度和对星形胶质细胞的损害［6］。这些研究均采用单纯星形胶质细胞或AQP4转染细胞培养。本研究使用原代大鼠大脑皮质混合细胞培养发现，AQP4抗体阳性血清不仅导致星形胶质细胞的减少，也可引起神经元的丢失，类似于NMO的病理改变，提示这是一种相对理想的研究NMO发病机制的体外模型。

该研究采用不同滴度的AQP4抗体阳性血清处理原代胎鼠大脑皮质细胞发现，AQP4抗体滴度越高，星形胶质细胞数目减少越严重，表明AQP4抗体对星形胶质细胞有滴度依赖性的神经毒性作用。推测AQP4抗体滴度越高，则和AQP4结合越多，激活补体和中性粒细胞募集越严重，对星形胶质细胞的损害越重。临床研究也发现AQP4抗体滴度和NMO疾病严重度有关。首先疾病复发时AQP4抗体滴度明显高于缓解期［7］；其次抗体滴度越高，视力损害、脊髓和脑部病变越严重，EDSS评分越高［8］；另外，免疫抑制治疗缓解疾病症状的同时血清AQP4抗体滴度也下降［9］。因此，作者建议在临床上定期检测NMO患者血AQP4抗体滴度，及时调整免疫抑制剂的用量，尽快降低AQP4抗体滴度，可促进NMO恢复和预防NMO复发。

本研究结果显示，AQP4抗体也可导致不表达AQP4的神经元数目减少，提示AQP4抗体间接导致神经元死亡。有关小鼠脑内注射AQP4抗体和人补体的NMO动物模型研究表明，除早期出现AQP4和GFAP表达丧失、髓鞘破坏、轴索损伤外，尚出现神经元延迟性坏死［1］。对星形胶质细胞和少突胶质细胞混合培养研究也表明AQP4抗体和星形胶质细胞AQP4结合，通过谷氨酸介导的兴奋性毒性作用间接导致少突胶质细胞损害［10］。细胞外谷氨酸含量增高对表达谷氨酸受体的神经元也有明显的兴奋性毒性，推测神经元损伤应是AQP4抗体和星形胶质细胞表面AQP4结合后，通过限制谷氨酸摄入改变谷氨酸内环境稳定，引起神经元死亡。另外AQP4抗体和星形胶质细胞AQP4结合，增加血－脑脊液屏障通透性，激活小胶质细胞以及炎性反应发生也可能发挥重要作用［11］。这也可部分解释NMO患者病变主要波及灰质和预后不良的原因。目前，NMO复发首选治疗方法为大剂量甲泼尼龙冲击疗法，尽管并未得到循证医学的证据支持。甲泼尼龙作为一种抗炎和免疫抑制剂通过多种机制发挥其作用。甲泼尼龙能抑制星形胶质细胞GFAP表达，阻止星形胶质细胞膜去极化，抑制炎性反应因子的产生和小胶质细胞的激活，促进神经元修复和轴突生长等［12－13］。本研究结果显示，尽管单独甲波尼龙预处理对体外培养的星形胶质细胞有一定毒性作用，但甲波尼龙预处理能明显减轻AQP4抗体对星形胶质细胞和神经元的毒性。甲泼尼龙通过何种机制发挥其神经保护作用仍需进一步研究。

总之，本研究表明AQP4抗体在体外对大鼠脑皮质星形胶质细胞和神经元产生滴度依赖性的细胞毒性作用，甲波尼龙可以中和AQP4抗体对大鼠皮质细胞的毒性，这为临床应用糖皮质激素治疗NMO提供了一定的理论依据。

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