TNFR1－383A／C基因多态性在散发性帕金森病患者中的分布及临床特点分析

周涌涛 刘佳 张燕莉 张新卿 郭秀海 陈彪 贾建平

帕金森病（PD）是老年人群中常见的神经系统变性疾病，尽管其发病机制尚不清楚，但越来越多的证据表明遗传因素和免疫机制参与了疾病的发生。研究发现PD患者脑组织中存在活化的小胶质细胞，并广泛表达细胞因子等炎性物质，且患者脑脊液中肿瘤坏死因子α（TNFα）等细胞因子水平升高，流行病学研究发现长期应用非甾体药物可减少 PD 的 发 生［1－3］。TNFα 与 TNF 受 体 1（TNFR1）相互作用可产生兴奋性毒性物质，导致线粒体结构异常，黑质神经元凋亡［4－7］。目前有关其受体多态性与PD之间关系的研究较少。一项来自德国人群的研究发现TNFRSF－609和＋36位点可能为PD的保护性因素［8－11］，近来研究发现TNFα的水平与PD患者非运动症状相关，如可影响患者的认知功能、睡眠及情绪等［12］。本研究采用病例对照的研究方法，探讨了TNFR1－383A／C基因多态性与PD之间的关联性，并探讨该基因多态性对PD发病年龄及运动症状的影响。

1 对象和方法

1.1 对象

1.1.1 PD组:共518例，来自宣武医院帕金森病专科门诊以及全国多中心的药物实验（北京、成都、上海、天津、长沙、武汉、青岛及哈尔滨）。入组标准:（1）符合 PD 诊断［13］；（2）年龄≥50岁；（3）无PD家族史；（4）经过1年以上随访。排除标准:（1）具有其他神经系统变性疾病；（2）患有脑血管病；（3）有精神系统疾病。平均发病年龄（61.35±8.34）岁，确诊时平均年龄（65.03±7.92）岁，其中男317例、女201例。所有患者均无遗传关联性，获得患者本人知情同意并签订知情同意书。

1.1.2 对照组:共521名，从北京老年化纵向研究的数据库（数据库共2200名北京社区人群，收集日期为2005－04－2009－06）中随机抽取，入组者第1次随访年龄在50岁以上且病史中无神经系统疾病者，共随访4年。

1.2 方法

1.2.1 实时定量荧光 PCR（real time PCR，RTPCR）［9］:（1）应用氯仿抽提的方法提取外周血中的DNA；（2）引物和Taq酶由Roche公司提供，应用RT－PCR［9］进行检测；两对引物序列为:第1对:上游 5′－TCCAGGACTGCATGGAC－3′和 下 游 5′－AAAAGTCCTTACCTCGGCAGT－3′，第2对:上游5′－GTCCAGGACTGCATGGAT－3′，下 游 5′－AAAAGTCCTTACCTCGGCAGT－3′；（3）RTPCR扩增的总体积为50μL，其中含有deltZ05、10×deltZ05缓冲液、10mmol／L dNTP、200μmol／L ROX、20×SYBR Green、80%（体积分数）甘油、100%DMSO。PCR反应条件:95℃初变性12 min，然后95℃20s，58℃退火20s，45个循环后，从60℃进行解离20min。实验操作流程和数据分析通过罗氏公司抽查和重复测试，进行质控。

1.2.2 TNFR1－383A／C 基因多态性与 PD 的相关性:分析TNFR1－383A／C基因型和等位基因频率在不同性别、发病年龄以及有无震颤者等之间的差异。

1.3 统计学处理 数据分析采用SPSS 11.5统计软件，应用Mantal－Haenszelχ2检验对计数资料进行分析，应用非条件Logistic回归模型进行多因素分析，并计算OR 和95%CI。应用 Kaplan－Meier、life table和 Cox－regression方法分析基因多态性对发病年龄的影响。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNFR1－383A／C基因型和等位基因频率TNFR基因型的分布符合Hardy－Weinberg平衡（P＜0.05）。病例组和对照组CC、CA和AA基因型分布无统计学差异（P＞0.05），C和A等位基因频率在两组间比较亦无统计学差异（P＞0.05）。PD患者发病年龄≥65岁亚组C等位基因频率显著低于对照组≥65岁亚组（6.74%vs.10.10%，P＜0.05），并可减少晚发型PD发病的危险性（OR:0.64，95%CI:0.43～0.97，P＜0.05）。两组同性别间未见C等位基因频率存在统计学差异（均P＞0.05）。具体结果见表1。

把病例和对照组进行年龄匹配，利用非参数Logistic回归模型对性别进行调整，未发现C／C基因型可影响SPD发病的危险性（OR:0.55，95%CI:0.13～2.33，P＝0.418），也未发现 TNFR1－383A／C／C等位基因对SPD发病有显著影响（OR:0.85，95%CI:0.61～1.19，P＝0.347）。

2.2 TNFR1－383A／C基因多态性对临床特征的影响 震颤组和非震颤组CC、CA和AA基因型的频率以及C和A等位基因的频率与对照组比较均无统计学差异（P＞0.05）（表1）。

表1 对照组和病例组TNFR1基因型和等位基因的分布 〔n（%）〕

2.3 利用生存分析确定基因多态性对发病年龄的影响 CC、CA和AA基因型患者的发病年龄的中位数分别为54岁（95%CI:46～62岁）、62岁（95%CI:58～66岁）和61岁（95%CI:60～62岁），各基因型患者间比较无统计学差异（P＝0.16），携带C／C等位基因的个体并未延迟SPD发病年龄。携带C和非C等位基因个体发病年龄的中位数分别为61岁（95%CI:58～64岁）与61岁（95%CI:60～62岁），两者间无统计学差异。利用生存分析进行研究发现携带C等位基因的个体并不能延迟SPD的发病年龄（C allele vs.non－C allele log rankχ2＝0.22，P＝0.86）。

3 讨论

TNFR1基因位于12p13.31，包含10个外显子，编码TNFR1蛋白的相对分子质量为55000～60000。TNFR1属于跨膜蛋白受体，膜外包括富含半胱氨酸的区域，有核细胞上均有低水平表达，包括大脑的各个区域，参与了TNF作用的调节，如成纤维细胞生长、内皮细胞激活或黏附、抗病毒、非淋巴细胞进行的细胞毒性作用和凋亡。在PD患者黑质多巴胺能神经元内发现TNFR1表达水平升高，但TNFR2的水平没有改变，并在动物模型中发现TNFR1对神经元具有毒害作用，而TNFR2则具有保护作用［4－6，14］。对于 TNFR1基因位点－609和＋36位点的研究发现其可能为PD发病的保护性因素，但目前尚未发现有关TNFR1－383A／C多态性与SPD之间关系的研究报道。

本研究结果显示，TNFR1－383A／C基因型和等位基因在病例组和对照组之间未存在统计学差异，病例组CC基因型频率低于对照组，并未发现CC基因型和C等位基因可影响SPD发病的危险性，通过对性别和年龄调整之后仍未发现两者间具有相关性。但按照性别和年龄分层分析后发现，高龄PD患者（发病年龄≥65岁）C等位基因频率显著低于对照组，并可减少晚发型PD发病的危险性，表明在发病年龄≥65岁人群中C等位基因仍是SPD的保护性因素，提示TNFR1－383A／C基因多态性与SPD的保护性作用有关。进一步分析TNFR1－383A／C对发病年龄的影响发现，具有C和A等位基因者的发病年龄无统计学差异，表明C等位基因并不能影响SPD的发病年龄。在临床工作中发现PD患者的起病形式有的以震颤为主，而许多患者并无震颤，而以运动迟缓和肌强直为主。本研究并未发现TNFR1－383A／C基因型和等位基因与SPD的临床表现存在相关性，表明该位点的多态性对SPD的运动症状并未产生影响。本研究与德国研究均发现该位点可能对SPD的发病具有保护性作用［8－11］。其机制可能为该突变位点可能通过影响TNF－αmRNA水平和表观遗传学机制调节TNF－α体内的水平，从而影响SPD的病理过程［14］。本研究在基因型和等位基因频率与其他研究结果之间存在差异［15－16］，其原因主要考虑与种族差异、地理区域以及饮食习惯不同等因素有关，也不能完全排除本研究中的病例对照区域不匹配导致。

综上所述，TNFR1－383A／C可能与SPD高龄人群的发病存在相关性，这与既往的动物实验、流行病学研究以及脑脊液生化研究的结果存在不同，因而需要通过对其他易感位点进行深入研究以确定其与SPD的关系。

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