奶山羊乳腺组织5－HTR7基因的克隆与序列分析

江青东，王慧杰，陈 宁

（1.郑州牧业工程高等专科学校继续教育学院，河南 郑州450011；2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆 乌鲁木齐830000）

5－羟色胺（5－HT）是一种吲哚衍生物，分子式C10H12N2O。5－羟色胺能与酸作用生成结晶盐 。其盐酸盐熔点167℃～168℃ ；苦味酸盐熔点185℃～189℃。5－羟色胺在脑组织中的浓度较高，它是调节神经活动的一种重要物质［1－2］。同时美国辛辛那提大学医学院的纳尔逊·霍斯曼和其他研究人员发现，5－羟色胺会发出一种信号，降低奶牛的产奶量。只要抑制奶牛乳腺中的5－羟色胺含量，就可以将产奶量提高15%。其机理是乳腺上皮合成的5－HT抑制了PRL对乳腺的刺激，影响乳腺的发育和泌乳，抑制PRL刺激的乳蛋白基因表达，这些作用可被5－HTR拮抗剂二甲麦角新碱阻断，提示是经过5－HTR产生的［3－7］。目前，针对哺乳动物5－HTR基因在乳腺组织中的分布尚未报道，本试验通过基因文库电子拼接及RTPCR技术克隆了奶山羊乳腺组织中5－HTR7基因，为进一步研究5－HT在其受体的作用下对哺乳动物牛的乳腺发育和调控泌乳方面提供理论基础。

1 试验材料与方法

1.1 试验动物及样品采集 取泌乳期奶山羊（购自陕西萨能奶山羊养殖基地）乳腺组织，入液氮速冻，置－80℃保存保存待测。

1.2 酶与试剂 AMV 反转录酶、RNase－Inhibitor、Oligo（dT）、TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、Buffer、DNA Marker、pMD－19T 载 体、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、E.coliJM109感受态细胞、T4DNA连接酶等，均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；动物组织RNAout，购自绵阳天泽基因工程有限公司。

1.3 PCR引物的设计及合成 根据GenBank公布的牛和鼠的5－HT受体－7基因的cDNA序列，利用Primer5.0引物设计软件和BLAST鉴定设计一对克隆引物。上游引物：5′－TCCTGACGCTCATCACGCTGCTG－3′，下游引物：5′－GAGAGAGTTTGCATAGCCCAGCCA －3′，预期片段810bp，引物由北京三博远志生物科学技术有限公司合成。

1.4 奶山羊乳腺组织总RNA的提取及含量测定按照动物组织RNAout试剂盒的说明进行提取乳腺组织总RNA：取0.1g乳腺组织，采用动物组织RNAout提取总RNA，溶解于20μL DEPC水中；取5 μL乳腺组织RNA提取液（其余－80℃保存备用），用0.8%琼脂糖凝胶电泳（130V，15min），紫外灯下观察，检查其完整性。紫外分光光度计测定OD260和OD280，检测RNA的纯度及计算含量（图1）。

图1 乳腺组织中总RNA电泳结果

1.5 RT－PCR法 cDNA合成反应体系：模板RNA 2μL，5×Buffer 4μL，dNTP Mix（2.5mmol/L）4μL，RNase Inhibitor（40U/μL）0.5μL，Oligo（dT）18（50 pmol/L）1μL，AMV（5U/μL）0.5μL，DEPC－H2O 6 μL，总体积20μL。混匀，室温放置10min，入42℃1 h，置－20℃冰箱备用。

PCR扩增体系：10×Buffer（Mg2＋）5μL，dNTP Mix（2.5mmol/L）6μL，25mmol/L MgCl26μL，rTaq（5U/μL）0.5μL，上、下游引物（20pmol/L）各1μL，cDNA 4μL，ddH2O 14μL，总体积50μL。

PCR反应程序：95℃变性5min；95℃10s，52℃20s，72℃30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。反应完成，分别取5μL PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶、100V、30min电泳。凝胶成像系统照像并检测PCR产物积分光密度（IOD）值，用各基因与β－actin的比值相对定量转录水平。

PCR产物回收：目的片断的回收参照上海生工生物工程技术服务有限公司UNIQ－10胶回收试剂盒说明书进行。

目的基因的克隆与测序：将PCR扩增产物纯化后，与pMD－19T载体连接，构建克隆载体。转化到JM109感受态细胞，进行蓝白斑筛选，重组质粒通过酶切和PCR鉴定：1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果；阳性菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.6 序列分析 利用BioXM 2.6、DNAStar软件及Blast、Smart进行分析。

2 结果与分析

2.1 RT－PCR扩增及克隆 RT－PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，得到了长度为810bp的目的片段（图2）。菌落PCR鉴定得到同样大小的目的片段（图3）。

2.2 奶山羊5－HTR7基因的克隆序列 测序结果及推测的氨基酸序列如图4。克隆的奶山羊5－HTR7基因包含一个完整的开放阅读框架（open reading frame，ORF），长为810bp，酸性氨基酸：46个；碱性氨基酸：70个；蛋白质分子量为：42.20 kDa，等电点：11.773。

图4 奶山羊5－HTR7的cDNA序列及其推测的氨基酸序列

2.3 奶山羊5－HTR7基因的种属差异分析DNAStar分析发现，奶山羊5－HTR7基因的ORF与猴（NM－00193683）、大熊猫（XM－002926833）、猪（NM－214101）、大 猩 猩 （ABO37534）和 人 （NM－000866）的同源性分别为21.3%、19.8%、20.7%、89.2%和76.2%（图5），推测氨基酸序列与人和大猩猩在基因进化方面可见，羊和人的同源性最高，其次是与人。Blastp序列比较分析，奶山羊5－HTR7基因推测氨基酸序列与人和大猩猩的同源性（Identities）分别为73%和64%，相似性（Positives）分别为81%和69%；Smart分析发现，奶山羊5－HTR7基因推测氨基酸序列信号肽与人、牛5－HTR7基因氨基酸序列信号肽均为1aa～17aa，SapB结构域均为59aa～126aa，结构特征与人、牛的5－HTR7结构特征相一致。这也许就是5－HTR7基因起重要生物学作用的蛋白片段，而这需要进一步的深入研究。

图5 奶山羊5－HTR7基因序列与猴、大熊猫、大猩猩和人5－HTR7基因序列的比较

3 讨论

5－HT分布全身，尤其在血小板和肠内更多，脑内主要是在中缝核及延脑中。迄今为止已发现人类5－HT受体至少有7大类，这7种类型又可进一步分成若干亚型［8－11］。按照受体转导方式的不同，可分为G蛋白偶联体超家族和配体门控离子通道族两大类。5－HT7受体的结构类似于5－HT6，有7个疏水的跨膜区，但含有一些保守性结构，有1个内含子，第5个跨膜区有保守的单丙氨酸残基。5－HT7在大脑中有着广泛的分布，在冠状动脉、胃肠道系统等周围组织中也很丰富［12］。目前5－HT受体激动剂和抑制剂都是用于神经系统的药物，治疗精神疾病［13－14］。况且没有专门针对5－HT 受体的药物，将这些化学药物用于奶牛，一是会影响奶牛的健康，最重要的是这些化合物会在奶里残留，进而影响人的健康。本试验通过牛和鼠在其他组织中的5－HTR7基因序列设计同源性引物采用RT－PCR方法克隆出奶山羊乳腺组织中5－HTR7的基因组全序列，据报道，5－HT在乳腺组织中主要与5－HTR7相互作用来影响哺乳动物的泌乳量，这将对下一步研究特异性针对乳腺中的5－HT受体，通过基因敲除技术，是一种绿色环保的药物，来提高哺乳动物的产奶量和养殖户的经济效益奠定理论和技术基础。

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