猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验替代方法研究Ⅰ家兔效力检验ELISA方法初探

蒋 卉，戴志红，王在时，关孚时，郭彩云，李 翠，温 芳，陆连寿

（中国兽医药品监察所，北京 海淀 100081）

猪瘟是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种高度接触性传染病。近年来，该病在美洲、亚洲、欧洲等国家和地区呈现散发的趋势，一些宣布已消灭猪瘟的国家又见猪瘟复发的报道［1］。该病尚无特效的治疗药物和方法，疫苗和疫苗接种是我国防治猪瘟的主要手段。20世纪50年代中期，中国学者成功培育出了猪瘟兔化弱毒株，简称“C株”［2］。1957年我国开始推广猪瘟兔化弱毒疫苗，开始采用家兔淋脾组织苗、后发展出乳兔组织苗、牛体反应苗，或以原代猪肾细胞、羊肾细胞、牛睾丸细胞培养的细胞苗［3］。

猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验是保证疫苗质量和有效性的关键。根据中华人民共和国兽用生物制品规程（2000版）规定，效力检验可采取用家兔效检或用猪效检。在实际生产过程中，用猪效检成本较高，周期较长，故多选用家兔效检。通过家兔体温反应和攻毒结果综合判定疫苗效力，然而体温反应多会受到家兔品种、个体差异、健康状况等的影响。酶联免疫吸附试验（ELISA法）是近年来飞速发展的一种免疫检测方法，是OIE指定的检测猪瘟抗体的可行方法［4］。本文采用IDEXX商品化的猪瘟抗体ELISA检测试剂盒对注射猪瘟兔化弱毒家兔血清样品进行检测，并且与体温反应结果进行比较，以便为ELISA方法应用于家兔效检提供依据。

1 材料与方法

材料

1.1.1 家兔 体重约2kg的健康大耳白兔，由瑞普保定生物药业有限公司提供。

1.1.2 IDEXX猪瘟抗体ELISA检测（以下简称IDEXX试剂盒） 试剂盒为美国IDEXX公司生产，试剂盒放置2℃～8℃保存。

1.1.3 猪瘟兔化弱毒毒种 病毒含量0.1g/支，由中国兽医药品监察所提供，－70℃保存，用于作为本试验的阳性对照。

1.1.4 试验用猪瘟兔化弱毒 病毒含量0.02g/支，由本实验室制备，－70℃保存，作为试验样品稀释接种家兔。

1.1.5 酶标仪 TECAN sunrise酶标仪。

方法

1.2.1 抗体检测时间的选择 将1支本实验室制备猪瘟兔化弱毒样品先用生理盐水稀释成0.01g/mL，后分别做1/150、1/300、1/450、1/600、1/750倍稀释，共5个稀释度。每个稀释度注射2只家兔，设猪瘟兔化弱毒毒种为阳性对照，注射2只家兔。按文献［5］方法观察体温反应，并于3d、5d、7d、10d、15d、20d、25d、30d家兔耳动脉采血1mL，分离血清用IDEXX猪瘟抗体ELISA试剂盒检测，确定家兔血清猪瘟抗体的检测时间。

1.2.2 接种与测温观察 将2支本实验室制备猪瘟兔化弱毒样品先用生理盐水稀释成0.01g/mL，后分别做1/150、1/300、1/450、1/600、1/750倍稀释，依次类推稀释到1/2 100倍，共14个稀释度。每个稀释度注射2只家兔，设猪瘟兔化弱毒毒种为阳性对照，注射2只家兔。生理盐水注射2只家兔为阴性对照，按文献［5］方法观察体温反应。

1.2.3 抗体检测与攻毒 根据抗体检测时间的选择试验结果，在接种猪瘟兔化弱毒后10d家兔耳动脉采血1mL，分离血清用IDEXX猪瘟抗体ELISA试剂盒检测。并按文献［5］方法对部分家兔进行攻毒试验，观察体温反应。

2 结果

2.1 抗体检测时间的确定 接种5个不同稀释度猪瘟兔化弱毒后，家兔的体温反应结果见表1，不同时间采集的血清样品抗体ELISA检测结果见图1。结果表明，所有家兔均产生了定型热反应（＋＋）或轻热反应（＋）。所有家兔在接种后3d和5d采集的血清样品猪瘟抗体检测结果均为阴性。7d采集的血清样品中，1/150倍稀释度下S2号家兔血清猪瘟抗体检测为可疑，阳性对照组S11号家兔血清猪瘟抗体检测为可疑，其余家兔血清样品猪瘟抗体检测结果均为阴性。10d采集的家兔血清样品猪瘟抗体检测结果均为阳性，以后每隔5d直至接种后30d所采集的家兔血清样品猪瘟抗体检测结果均为阳性，ELISA阻断率无明显降低。通过该试验结果确定接种猪瘟兔化弱毒后，家兔血清猪瘟抗体检测时间为10d。

表1 5个稀释度家兔热型判定

2.2 家兔测温和抗体ELISA检测结果 2支猪瘟兔化弱毒样品做14个不同稀释度接种后，家兔测温结果以及兔血清猪瘟抗体ELISA检测结果见表2。结果表明，除阴性、阳性对照组外，28组家兔接种不同稀释度猪瘟兔化弱毒后，有24组出现了2只家兔均为定型热反应（＋＋），或者1只家兔为定型热反应，另1只家兔为轻热反应（＋），其中23组家兔血清猪瘟抗体检测均为阳性，两者符合率可达95.83%，1组家兔虽表现为定型热反应和轻热反应，但轻热反应家兔血清猪瘟抗体检测为阴性。28组家兔中有4组没有表现出典型的热反应：1/1 500稀释度1号样品组中19号兔为可疑反应（±），19′号兔为轻热反应，但2只家兔血清猪瘟抗体检测均为阳性；1/1 950稀释度2号样品组26号兔为无反应（－），26′号兔为可疑反应（±），其血清猪瘟抗体检测均为阴性；1/2 100稀释度1号样品组中2只家兔均为轻热反应，血清猪瘟抗体检测均为阳性；2号样品组中28号兔可疑反应，血清猪瘟抗体检测阳性，28′号兔无反应，其血清猪瘟抗体检测阴性。

根据接种后家兔体温反应和热型判定结果，对没有出现典型热反应的4组家兔进行攻毒试验，同时设2只阳性对照兔，攻毒测温结果见表3。结果表明，ELISA猪瘟抗体检测为阴性的家兔攻毒后均出现了定型热反应，而猪瘟抗体检测为阳性的家兔攻毒后出现了无反应、轻热反应和可疑反应的3种不同反应类型。综合分析说明，家兔体温反应与ELISA抗体检测结果具有较高的正相关性，特别是在低稀释度的组别中两项结果的符合率达到100%，在高稀释度组别的判定中ELISA方法的敏感度更好。在家兔效力检验中根据体温反应判定结果，其结果会受到家兔个体差异等原因影响，而ELISA方法用于家兔效力检验的判定，其敏感性、准确性和稳定性更佳。

图1 各稀释度家兔血清抗体ELISA检测ELISA阻断率≤30%判为阴性；ELISA阻断率≥40%判为阳性；30%＜ELISA阻断率＜40%判为可疑

表2 14个不同稀释度家兔热型判定和血清猪瘟抗体ELISA检测

表3 攻毒后家兔热型判定

3 讨论

ELISA方法目前已在实践中被广泛用于猪瘟抗体的检测，在疫苗的免疫效果评价和阴性猪筛选工作中发挥了巨大作用。与其他血清学检测方法相比，该方法具有操作简便、快速的特点［6］，其结果更具有良好的重复性和稳定性。本试验通过比较猪瘟兔化弱毒疫苗家兔效力检验体温反应与猪瘟抗体ELISA检测结果的相关性，给出了ELISA方法用于家兔效力检验的可行性。虽然本研究依然采用家兔进行效检，但省去了传统方法每6h家兔测温1次的工作，大大减轻疫苗检验工作的强度，避免了传统方法中因家兔质量和环境等因素对体温检测结果的影响。家兔血清猪瘟抗体ELISA结果比体温反应更准确直接地反映了活疫苗的效力，提高了检测结果的可靠性和可重复性。

本研究通过检测接毒后不同时间的家兔血清猪瘟抗体，确定采血检测猪瘟抗体的最佳时间为10d。10d以前家兔血清抗体ELISA检测基本都为阴性，ELISA阻断率较低。10d家兔血清猪瘟抗体ELISA检测全为阳性，ELISA阻断率达到较高值，以后至30d家兔血清猪瘟抗体ELISA检测阻断率无明显下降。在确定抗体检测时间的试验中，只选择了1/150、1/300、1/450、1/600、1/750倍这5个较低稀释倍数注射家兔，监测不同时间家兔血清抗体变化，以确保有足够的病毒量使机体产生抗体。尽管本方法比起传统体温反应的判定时间有所延长，但是可以有效地排除体温检测中轻热反应和可疑反应带来的不确定性，避免再进行攻毒试验，从而提高检验工作的效率和检验结果的准确性。

通过比较分析，本试验的各项结果，表明IDEXX猪瘟抗体ELISA试剂盒检测结果与家兔体温反应结果有很高的符合率，在病毒高稀释度条件下，猪瘟抗体ELISA检测可以有效地对体温反应可疑或者轻热的家兔进行判定，避免了体温反应结果产生的不确定性，同时省去了攻毒试验的工作量。本试验只使用了一种商品化的猪瘟抗体ELISA检测试剂盒，该种试剂盒目前在国内使用广泛，具有一定代表性。其他商品化的猪瘟抗体ELISA试剂盒是否与家兔体温反应有较好相关性还需要进一步的试验验证。但是本试验可以为ELISA方法用于家兔效力检验提供有力依据。

［1］ Stegeman A，Elbers A，de Smit H ，etal.The 1997－1998 epidemic of classical swine fever in the Netherlands［J］.Vet Microbiol，2000，73：183－196.

［2］ 仇华吉，童光志，沈荣显.猪瘟兔化弱毒疫苗－半个世纪的回顾［J］.中国农业科学，2005，38（8）：1675－1685.

［3］ 朱良全，彭隽，王栋.猪瘟疫苗研究进展及我国传统疫苗的研究现状［J］.中国兽药杂志，2005，39（2）：33－37.

［4］ 高金源，陈晓春，吴华伟，等.猪瘟抗体阴性猪筛选方法的比较［J］.中国兽药杂志，2011，45（1）：20－21.

［5］ 农业部第四届兽用生物制品规程委员会.中华人民共和国兽用生物制品规程（2000年版）［M］.北京：化学工业出版社，2000.

［6］ 苗得园.Herdchek猪瘟抗体ELISA试剂盒在猪瘟控制中的应用［J］.中国兽医杂志，2006，42（11）：50－51.