巴马香猪类固醇激素急性调节蛋白（StAR）基因真核表达载体的构建及鉴定

吴 群，魏 泓，肖 榕，卿利娟，葛 亮，李 婧，商海涛，郑小波，刘 宇

（1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌402460；2.中国人民解放军第三军医大学基础部实验动物学教研室，重庆 沙坪坝400038）

类固醇激素合成急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR），也称类固醇激素灵敏调节蛋白，是促进胆固醇由线粒体外膜转入到线粒体内膜的一种转运蛋白，在胆固醇的代谢以及类固醇激素的合成中起关键的限速作用［1］。研究表明，StAR不仅存在于类固醇激素生成组织（肾上腺、睾丸、卵巢），而且表达于其他组织中，其中研究最多的是肝脏［2－3］。此外，StAR在调节睾酮的合成过程中起重要的作用，是维持正常生理功能所必须的一种重要蛋白［4］。最近的研究表明，StAR通过调节胆汁酸的合成，增加胆固醇的排泄，为脂肪肝等脂类代谢异常类疾病的防治提供了一条新的途径［5］。目前，国内外对StAR蛋白的研究主要集中在啮齿动物，关于猪StAR蛋白的调节功能及其机制的研究较少。

为此，本试验根据NCBI上发布的猪StAR基因cDNA序列（NM_213755.2），对巴马香猪StAR基因进行克隆，旨在构建真核表达pEGFP－C1－StAR载体，为进一步探讨StAR基因表达产物的生物学活性以及功能提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 猪睾丸组织 取自解放军第三军医大学实验动物教研室学校猪场，健康巴马香猪睾丸组织。

1.2 菌株、质粒和试剂 菌株E.coliDH5α、反转录试剂盒等，购自TaKaRa公司；RNA快速提取试剂盒，购自北京艾德莱公司；pEGFP－C1载体由本实验室保存。

1.3 引物设计和合成 根据NCBI上发布的猪StAR基因cDNA序列，交由TaKaRa公司合成，下划线为酶切位点，引物序列如下所示：

上 游 引 物：5′－GCTAGCTGCCTCCGCTACCAGGAAACA－3′，（含 NheI的酶切位点）；

下 游 引 物：5′－GAATTCGCTGAGCTTTAACACCTGGCTTC－3′，（含EcoRⅠ的酶切位点）。

1.4 StAR基因全长cDNA的获得 用RNA提取试剂盒从睾丸组织中提取总RNA。RT－PCR扩增总RNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，获得巴马香猪的StAR基因。回收目的片段。

1.5 StAR基因克隆载体的构建 目的片段接连至pSURE－T克隆载体的反应液于16℃连接过夜。转化入E.coliDH5α，进行蓝白斑筛选，扩大培养白色菌落。对菌液双酶切初步鉴定后，挑选阳性克隆菌液送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.6 pEGFP－C1－StAR真核表达载体的构建 将克隆阳性质粒和pEGFP－C1载体质粒经NheⅠ和EcoRⅠ进行大体系双酶切。回收目的基因序列和线性化的载体序列，在T4连接酶作用于16℃连接过夜，转化后挑取阳性菌落，经酶切鉴定和测序，所得重组克隆载体命名为pEGFP－C1－StAR。

2 结果

2.1 StAR基因的RT－PCR扩增 以巴马香猪的总RNA为模板进行RT－PCR扩增，在858bp处出现1条明显的条带，它与预期估计值较为接近（图1－A）。

2.2 克隆质粒pSURE－StAR质粒PCR鉴定 将纯化后的StAR的PCR产物与pSURE－T载体连接，转化到E.coliDH5α受体菌，获得的重组质粒经PCR扩增后出现目的片段（图1－B）。

2.3 pEGFP－C1－StAR 重组质粒的 PCR 检测与酶切鉴定 以pEGFP－C1－StAR重组质粒为模板，进行PCR扩增，观察到1条长度在750～1 000bp的特异性条带（图1－C）。pEGFP－C1－StAR 重组质粒用NheⅠ和EcoRⅠ进行酶切鉴定，可以看到目的条带清晰且片段大小正确（图1－D）。

图1 StAR基因载体构建与鉴定

2.4 测序结果 如下引物图为巴马香猪StAR基因序列。

2.5 StAR基因ORF序列同源性分析和碱基差异比较 对测序所得的StAR基因序列与GenBank中发表的3个StAR蛋白序列进行同源性比较（图2）和碱基差异比较（表1）。结果表明，巴马香猪StAR基因ORF序列与其他参考序列的同源性高达99.3%～99.8%。

图2 猪StAR基因ORF序列同源性分析

表1 猪StAR基因碱基差异比较

2.6 同源性进化树分析 利用DNA Star软件构建分子进化树（图3），从进化树中可以看出巴马香猪单独成枝，不存在与其他猪种相互渗透，与其他枝叶的进化距离较远。

3 讨论

巴马香猪是我国特有的小型猪品系资源，其在解剖结构、生理代谢等方面与人体具备高度相似性，且猪遗传修饰相对容易，建立猪的基因工程模型已成为当今世界生物医药研究的热潮。因此，巴马香猪作为一种地方纯种猪，将是研究疾病模型的重要选择。

图3 猪StAR cDNA序列的分子进化树

研究表明，许多疾病与StAR基因存在密切的关系。例如，先天性脂样肾功能增生综合征（CLAH）是StAR蛋白基因突变所引起的常染色体隐性遗传性疾病［6］。此外，在多囊卵巢综合征（PCOS）中，StAR 蛋白在内膜细胞和颗粒细胞中过度表达，造成颗粒细胞不成熟黄体化［7］。Ning等［5］的研究表明，StAR表达与年龄及血脂有一定的联系，为进一步探讨脂质代谢紊乱在动脉粥样硬化中的作用奠定了基础。另外，StAR基因是类固醇激素合成的关键性调节因子，在睾丸激素调控方面起着重要的作用。

StAR在不同物种间一致性为85%～90%，相似性大于90%［8］。本试验从巴马香猪扩增得到了StAR基因ORF区序列，全长858bp，编码285个氨基酸，序列分析表明，扩增的猪StAR基因ORF区序列与GenBank中3个猪StAR基因mRNA序列（登录号为 AB530157.1、AY368628.1、AY800265.1）的同源性为99.3%～99.8%。StAR的氨基端（N′－端）由62个氨基酸组成的线粒体引导序列；羧基端（C′端）为生物活性部位，可与脂质或胆固醇结合，大约由210个氨基酸组成，该结构域称为StAR相关脂质转运结构域（START）［9］。缺失 C－末端第28氨基酸会致使StAR失去活性［10］。经文献分析表明，构建的StAR序列第26位氨基酸与其他猪种存在差异。

构建真核表达载体是研究蛋白功能的一种重要工具。本试验成功扩增和克隆了猪StAR基因，并构建了猪StAR的真核表达载体pEGFP－C1－StAR，为下一步StAR基因在猪睾丸间质细胞中的特异性表达做准备。

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