猪源乳酸杆菌齐市地方株的分离与种属分析

邱景会

（黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

猪用益生菌制剂可调节猪肠道内微生态平衡，对宿主动物产生益生作用。我国临床应用的微生态制剂菌株大概有6 种，即乳酸杆菌、乳酸链球菌、粪链球菌、芽孢杆菌、双歧杆菌和酵母菌[1-2]。其中以乳酸杆菌最为常用，该菌为仔猪肠道正常微生物区系中的优势菌群，可利用糖类发酵产生大量乳酸，有的还产生乙酸及其他挥发性脂肪酸，对致病菌具有很好的抑制作用，对维持仔猪肠道微生物区系平衡和消化机能起着重要作用[3-4]。

由于猪的品种不同，养殖地域不同，优势菌群也有差异。选择特异的优势菌株是研制猪用益生菌制剂的关键。所以，本研究拟从齐齐哈尔周边地区健康仔猪肠道中分离筛选出猪源特异性乳酸杆菌，用来研制猪用微生态制剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 粪便样品

在齐齐哈尔市龙江县，甘南县，富裕县及泰来县等地区相关猪场，选定21～35 日龄长白、大白、杜洛克、二元及三元杂交健康仔猪，用灭菌棉签蘸取新鲜粪样，置于灭菌EP 管中，共采集粪样15 份。送至实验室进行细菌分离。

1.1.2 试剂和设备

MRS 琼脂和MRS 肉汤（北京陆桥技术有限责任公司），细菌生化鉴定管（杭州天和微生物试剂有限公司），电子天平，恒温培养箱，超静工作台。

表1 乳酸杆菌属鉴定结果

1.2 方法

1.2.1 粪便样品处理

将采集的仔猪粪样置于装有50 mL灭菌生理盐水含玻璃珠的锥形瓶中。将锥形瓶置于摇床振荡5 min（160 r/min），然后将原液进行10 倍系列稀释，自10-1至10-9，共9 个稀释度。

1.2.2 菌株分离、染色和镜检

分别取10-7至10-93 个稀释度的粪样混悬液各0.l mL 涂布于MRS 平板，37 ℃恒温厌氧培养24～48 h。挑取各种不同菌落进行革兰氏染色如图1，镜检，观察菌体形态。

图1 嗜酸乳杆菌革兰氏染色图片

1.2.3 菌株的纯化

挑取疑似菌落进行纯化，记录并观察菌株形态特征。

1.2.4 分离菌株的生理生化鉴定

按照乳酸杆菌属和种的生理生化鉴定指标[5-6]，分别进行厌氧生长试验、运动性试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、过氧化氢酶试验、吲哚试验。若厌氧生长试验为阳性，其他均为阴性，可初步定为乳酸杆菌属。再进行糖醇类发酵产酸试验（阿拉伯糖、葡萄糖、葡萄糖酸盐、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、棉籽糖、甘露醇、松三糖、核糖、山梨醇、蔗糖、木糖、七叶苷、水杨素），结果与《伯杰细菌鉴定手册》对照，从而进行乳酸杆菌种的鉴定。

表2 乳酸杆菌种间生化鉴定结果

2 结果

2.1 菌落形态特征

通过厌氧分离纯化，共获得革兰氏阳性，无芽孢杆菌12 株，其中菌株SY1 和SY2 菌落形态基本相同，均为圆形、边缘不整齐、表面粗糙、扁平、灰白色菌落，菌落直径1.0～2.0 mm；菌株DYF3 和DYF4 为圆形、边缘整齐、表面光滑、白色菌落，菌落直径1.0～2.0 mm。

2.2 染色特性

对分离出的所有菌株进行了革兰氏染色，其中12 株为革兰氏染色阳性无芽孢杆菌，长短不一，单个、成对、个别排列呈短链状。

2.3 菌株的生理生化鉴定结果

2.3.1 乳酸杆菌属的鉴定结果

通过运动性试验，厌氧生长试验，过氧化氢酶试验，硝酸盐还原试验，吲哚试验，明胶液化试验等7 个鉴定指标，共5 个菌株符合乳酸杆菌属的鉴别特征。可以初步确认为乳酸杆菌属。具体结果见表1。

2.3.2 乳酸杆菌种间鉴定结果

乳酸杆菌种的鉴定主要是进行糖醇类发酵产酸试验，在本研究中共应用了15 种糖醇。其中RS1 和RS2 两株乳酸杆菌有14 种糖醇发酵产酸的鉴定结果符合嗜酸乳杆菌的鉴别特征，仅木糖不完全相符，可确定这2 株乳酸杆菌为嗜酸乳杆菌；菌株RS3 和RS4 仅山梨醇不完全符合植物乳杆菌鉴别特征，可确定其为植物乳杆菌；菌株RS5 仅松三糖和甘露醇不完全符合干酪乳杆菌假植物亚种鉴别特征，可确定其为干酪乳杆菌。具体结果见表2。

3 结论

在齐齐哈尔周边地区部分猪场采集的健康仔猪粪样中，共分离得到了乳酸杆菌5 株。其中嗜酸乳杆菌2 株，植物乳杆菌2 株，干酪乳杆菌1 株。

近年来，微生态制剂在世界范围内得到了广泛的开发和应用，并且促进了养猪业的迅速发展。国内外众多学者针对猪肠道益生菌的种类，生物学特性，种属特异性已有了较深入的研究，并开发出了诸多益生菌制剂产品，广泛应用于临床[7-8]。我国微生态制剂的研究和应用起步较晚，但相对起点高。许多领域内的大型企业已经按照国际标准建设了生产技术先进、产能高的微生态制剂生产线。

然而，实践中发现仍有许多养殖户对猪用微生态制剂的临床应用效果怀有质疑。主要是因为饲喂后没有达到预期效果。分析其原因：

一方面，可能与益生菌菌株特异性以及猪只生长发育阶段有关系。应根据猪只不同生长发育阶段肠道益生菌菌群特点，研发针对仔猪各个生长阶段专用的益生菌制剂产品[9-10]。

另一方面，虽然许多微生态制剂领域内的企业已经按照国际标准建设了生产技术先进、产能高的微生态制剂生产线，但在益生菌种数量、制剂活菌数及保存期和生产总产量等方面同国外产品还存在一定的差距。

本研究鉴定得到的5 株乳酸杆菌，均分离自齐齐哈尔周边地区健康仔猪肠道，具有地区特异性和物种特异性。通过安全性试验，耐受力试验及发酵条件等试验，进一步研究这些乳酸杆菌在不同生理环境中的特性，可筛选适合于生产猪源微生态制剂的乳酸杆菌菌株。为研发适用于齐齐哈尔市周边地区的猪用益生菌制剂提供科学依据。

[1] 黄聪亮.乳酸菌制剂的研究及发展现状[J].安徽农学通报，2007，12（16）：42-44.

[2] Collado M C，Grze!kowiak L，Salminen S. Probiotic strains and their combination inhibit in vitro adhesion of pathogens to pig intestinal mucosa. Curr Microbiol[J]，2007，55(3)：260-265.

[3] 王君.微生态制剂研究进展与应用现状[J].现代畜牧兽医，2007 (1)：52-54.

[4] 复合菌制剂及其在断奶仔猪生产上的应用[J].湖北农业科学，2009，48(9)：2202-2205.

[5] 张媛，毛玉杰.乳酸杆菌及其在微生态制剂中的作用[J].辽宁畜牧兽医，2004（3）：42-44.

[6] 凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999：6-15.

[7] 胡珊，胡事君，吴清平，等.益生菌制剂加工技术的研究概况[J].中国乳品工业，2010，38(3)：47-50.

[8] 张建友，李艳武，等.冻干乳酸菌菌种增菌培养基的优化[J].乳品工业，2002，30(5)：40-43.

[9] Metzler B, Bauer E, Mosenthin R. Microflora management in the gastrointestinal tract of p iglets.Asian2Australas [J]. J Anim Sci，2005(18)：1353-1362.

[10] Huang C，Qiao S，Li D，et al. Effects of lactobacilli on the performance, diarrhea incidence，VFA concentration and gastrointestinal microbial flora of weaning pigs [J]. Asian2Australas J Anim Sci,2004(17)：401-409.