一种快速鉴定猪舍空气样品中金黄色葡萄球菌的方法

柳敦江, 王 鹏

（1.大北农集团动物保健技术研发中心，北京 101407 ；2.南京市畜牧家禽科学研究所，南京 210036）

金黄色葡萄球菌是自然界中常见的一种革兰氏阳性菌,其产生耐热核酸酶，凝固酶，肠毒素等使其致病力很强，污染食物常引起食物中毒等，在这方面其危害仅次于沙门氏菌与溶血弧菌[1]，同时近年来，由于养殖环境中各种抗生素的滥用，导致各种耐药金黄色萄萄球菌的产生，甚至出现了耐各类抗生素的“超级细菌”[2]。有人曾把肝炎、艾滋病与金黄色葡萄球菌并称为世界上三大难治的传染性顽病[3]，所以迅速采集、鉴定各个不同环境中存在的金黄色葡萄球菌，并对其做耐药和毒力方面的研究，从而掌握各个地区金黄色葡萄球菌的耐药性其传播的研究至关重要 ，金黄色葡萄球菌的传统培养基一般都是针对其培养特性而设计[4]，如高盐甘露醇是针对其耐盐，产酸的特点，而Baired-Parker 培养基是其鉴别培养基，通过抑制别的细菌生长且还原亚碲酸盐而鉴别，而凝固酶试验则是根据其是否产生凝固酶使血浆凝固而进行判断，这些试验都是建立在生化反应的基础之上，但是往往伴随着假阳性与假阴性的产生，而且此方法耗时较长，需要3～5 d 的时间 ，并且易导致漏检或检出错误，常见的鉴定金黄色葡萄球菌的试验有革兰氏染色镜检，凝固酶试验，凝集反应等采用免疫学检测方法如乳胶凝集试验和ELISA，虽可缩短检测时间，但是由于其工作原理是抗原抗体的中和反应，因此会受到食物成分及葡萄球菌A 蛋白的影响。

显色培养基的面世是对传统检测手段的一个突破，一种基于对微生物的产酶特性认识不断深化而设计的一种新型培养基产品，显色培养基在选择性培养基中加入目标微生物特征性酶的显色底物，将微生物的选择性培养和特征性酶的测试联合在一起。当目标微生物在培养基上生长时，其特征性酶就能降解显色底物并产生带有特殊颜色的代谢物，使菌落形成特定的颜色[5]。而干扰菌或被抑制，或不产生特征性酶而不显色，因而能被区别 。当显色培养基上生长菌落之后只要通过简单的菌落颜色形态观察或简单试验就能确定。

金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶是一种热稳定性的DNase,通常被认为是金黄色葡萄球菌的重要标志[6-7]，有国外学者研究表明耐热核酸酶与致病性的金黄色葡萄球菌的符合率为98.3%[8]。国外已将检测耐热核酸酶作为致病性金黄色葡萄球菌的筛选手段，所以编码耐热核酸酶的基因也就成为PCR 技术检测金黄色葡萄球菌的首选靶基因。通过对金黄色葡萄球菌中的nuc 基因中的保守片段设计引物进行扩增可以鉴别金黄色葡萄球菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

金黄色葡萄球菌显色培养基（青岛海博生物），普通营养琼脂（杭州天和）。

1.1.2 测试菌株

金黄色葡萄球菌ATCC25923 由山东农业大学赵宏坤老师实验室赠，表皮葡萄球菌,伤寒沙门氏菌,大肠杆菌，巴氏杆菌，粪肠球菌，链球菌，单增李斯特氏菌皆为山东农业大学环境微生物实验室保藏。

1.1.3 主要试剂和仪器

Andersen-6 级撞击式空气微生物采样器（辽阳市医疗器械厂）。DH 4 000A 型电热恒温培养箱（中国天津市泰斯特仪器有限公司），电热鼓风干燥箱（ZB101 -Ⅰ型，山东淄博仪表厂）无菌超净工作台（AIR TECH，苏净集团安泰公司制造）。

1.1.4 引物设计

根据NCBI 基因文库公布的金黄色葡萄nuc 基因序列,查找到nuc 基因的序列号为V01281。

根据Brakstad 等设计的引物序列，nuc 正向5!- GCGATTGATGGTGAT ACGGTT-3′，nuc 反向5′-AGCCA AGCCTTGACGAACTAAAGC-3′，扩增257033-257311 之间的279 bp 的片段。并由大连宝生物合成。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的采集

Andersen-6 级撞击式空气微生物采样器在猪场中采集空气样品，采样器的放置高度为70 cm.采样介质为金黄色葡萄球菌显色培养基。

1.2.2 样品的培养

将采样后的平皿放在37 ℃恒温箱中培养24 h，观察平板上生长的菌落，然后挑取蓝绿色的可疑菌落接种到普通琼脂培养基上培养继续培养18～24 h。

1.2.3 DNA 模板的制备

刮取普通营养琼脂上生长的菌苔置于盛有150 μL 双蒸水的1.5 mL 离心管中，放在沸水中煮沸10 min ,11 000 r/min， 离 心1 min, 取上清液，备用 。

1.2.4 反应体系的建立

反应液包括10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，上下游引物各1 uL，模板2 μL，双蒸水补足50 μL。

1.2.5 扩增反应参数

预 变 性94 ℃ 5 min，变 性94 ℃1 min，退火53 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，进行35 个循环，再72 ℃延伸5 min。

1.2.6 电泳条件

1.5%琼脂，90 V，30～35 min.

1.2.7 确定

将检出的阳性菌株放在API 20E 标准生化鉴定系统上检测。

图1 金黄色葡萄球菌在显色培养基上的菌落图

表1 其它对照菌在显色培养基上的生长状况及显色效果

图2 PCR 产物电泳结果

2 结果分析

2.1 显色培养基上的检测结果

金黄色葡萄球菌显色培养基经恒温培养24 h 后，显现出蓝绿色（见图1）。

2.2 PCR 扩增产物特异性的检测结果

在金黄色葡萄球菌显色培养基上挑取32 株可疑菌经过PCR 电泳后结果有28 株菌出现279 bp 的条带，其与PCR的结果吻合度为84.4%（见图2）。

2.3 标准生化鉴定系统检测结果

将PCR 产物的阳性结果菌株经API 20E 自动生化鉴定仪检测后，28 株可疑菌均为金黄色葡萄球菌，而5 株阴性菌株经测有一株为金黄色葡萄球菌，而其余四株均为杂菌。

3 结论

本研究直接从空气中采集样品，用金黄色葡萄球菌显色培养基培养后，利用PCR 技术 ，成功地检测出空气中的金黄色葡萄球菌。且检测准确率极高。目前用传统的方法来检测金黄色葡萄球菌，费时费力，一般如果顺利的话需要5～6 d 的时间，而单纯的用显色培养基来检测，由于空气中的杂菌和其他因素的影响，会产生较高的假阳性，而运用显色培养基与PCR 方法的结合，则大大降低了金黄色葡萄球菌的检出错误率，且可以大幅度地减少检出的时间，一般从空气采样到检出2 d 时间就可以完成 ，这为我们快速地检测医院及各种公共场合中的金黄色葡萄球菌，并且对其进一步的研究提供了便利，具有极高的潜在应用性。

［1］ 吴仲梁，韩伟，陶军，等．快速检测食品中金黄色葡萄球菌的检测方法[J]．中国食品工业，2003(6)：56-57．

［2］ 姜延龙，张宇，田波，等.PCR 技术检测金黄色葡萄球菌进展[J].食品科学，2006（5）：245-249.

［3］ 张琳，李敏，于莉，等.食品中金黄色葡萄球菌检测方法的比较研究[J].食品工业科技，2006（6）：161-164.

［4］ Gaillot O, Wetsch M , Fortineau N, et al. Evaluation of CHROM agar Staph.aureus, anew chromogenic medium, for isolation and presumptive identification of Staphylococcus aureus from human clinical specimens[J]. Clin. Microbiol.2000.38:1587-1591.

［5］ Silva B O,Caraviello D Z, Rodrigues A C,et al.Evaluation of Petrifilm for the isolation of Staphylococcus aureus from milk samples[J].J Dairy Sci，2005,88(8):3000-3008.

［6］ Lowy F D.Staphylococcus aureus Infections[J].N Engl J Med.1998，339:520-532.

［7］ Ballal A, Ray B, Manna A C.sarZ, a sarA Family Gene,Is Transcriptionally Activated by MgrA and Is Involved in the Regulation of Genes Encoding Exoproteins in Staphylococcus aureus[J].Bacteriol,2009,191: 1656!1665.

［8］ Tatini S R,Cords B R.Gramoli j:Screening for staphylococcal enterotoxins in food[J]. Food Technol,1976，31：64-74.