APP下载

胰岛素样生长因子-1对小鼠病毒性心肌炎心肌细胞凋亡蛋白p53的表达的影响

2013-11-21湖北医药学院附属太和医院儿科十堰442000李堰松顾教伟李敬风

陕西医学杂志 2013年1期
关键词:组织化学心肌细胞灰度

湖北医药学院附属太和医院儿科(十堰442000) 顾 坚 李堰松 顾教伟 李敬风

细胞凋亡在病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VM)的病程中发挥着重要的作用,而在细胞凋亡过程中,p53蛋白起着至关重要的作用[1]。动物实验及临床研究表明:胰岛素样生长因子-l(IGF-1)可增强心脏功能,抑制心肌细胞凋亡。本组通过研究外源性IGF-1对VMC小鼠心肌的保护作用对临床应用提供依据。

材料与方法

1 动物与试剂 CVB3Nancy株购自湖北省实验动物中心病毒室,病毒原液效价为10-6半数组织培养感染量(TCID50)/ml,Balb/c雄性小鼠60只购自湖北省实验动物中心。4~6周龄;体质量l3~16g。小鼠IGF-1购于深圳达科为生物技术公司,p53抗体、SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉生物技术公司。

2 心肌炎模型的制备和分组 将小鼠随机分为感染组20只,治疗组20只,每只腹腔接种0.1ml/106TCID50/ml的柯萨奇B3病毒(CVB3)稀释液;对照组20只,每只腹腔接种0.1ml不含CVB3的Eagles液。治疗组从接种病毒稀释液当日开始每天予腹腔注射外源性IGF-1[100μɡ/(kg·d)],连续10d。

3 标本的留取 各组小鼠于治疗后第10天全部断颈处死并留取心脏。心脏标本用40g/L甲醛固定,石蜡包埋,组织切片,待免疫组织化学检测。

4 检测指标 免疫组织化学S-P法检测心肌组织中p53表达:石蜡标本脱蜡,p53采用微波、高压抗原修复,滴加正常动物血清,过夜,滴加一抗为p53兔多克隆抗体(1∶200),4℃过夜,滴加生物素化二抗,滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物,3,3'-二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。阳性结果判断:p53阳性表达主要定位于细胞内,呈棕黄色颗粒样。在HPIAS2000型图像(武汉同济千屏影像工程公司)分析仪上,每个切片随机取5个高倍视野,测定一定面积内阳性信号面积和阳性信号平均灰度值乘积,阳性信号指数=阳性信号面积×阳性信号平均灰度/测定面积×100。

5 统计学处理 本组对所有数据采用SPSS13.0软件包进行处理,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为有显著性差异,P<0.01为有极显著性差异。

结 果

心肌组织中p53的表达见附表。p53阳性细胞主要为炎性细胞浸润的周围心肌细胞。p53阳性表达主要定位于细胞内,呈棕黄色颗粒样分布。

附表 各组小鼠心肌组织p53灰度值比较(±s)

附表 各组小鼠心肌组织p53灰度值比较(±s)

注:★与对照组比较,P<0.01;#与治疗组比较,P<0.01

组 别 n p53对照组 20 118.6±10.4感染组 20 167.9±15.6★#治疗组 20 123.5±11.2

讨 论

VMC是常见的心血管疾病,其发病机制目前仍不完全清楚。但近年的研究已证明其损害心脏的主要机制包括两个方面:即病毒对被感染心肌的直接损害和病毒触发人体免疫反应而引起心肌损害。其中,炎性细胞浸润所诱导的心肌细胞凋亡在心血管疾病的发生和发展中占有重要作用[2]。机体中的IGF-1主要由肝细胞分泌,部分来自组织的自分泌或旁分泌。研究表明:IGF-1对心脏具有重要的生物学效应,能提高心肌梗死后、心力衰竭、扩张型心肌病及正常心肌功能,具有促进心肌修复和组织重构,扩张冠状动脉,保护缺血心肌的作用[3]。目前关于IGF-1与VMC关系的报道非常少见。心肌组织的IGF-1除来自血液循环外,其本身也具有分泌IGF-1能力。在胚胎、出生后及成年鼠心肌中均可检测到IGF-1mRNA和IGF-1蛋白[4]。

细胞凋亡为细胞在生理或病理状态下有序死亡过程。在VMC中,细胞凋亡是伴随心肌局部炎性细胞浸润的一种重要形式。p53蛋白是目前公认的促细胞凋亡蛋白,其本质是一种核磷酸蛋白,在细胞DNA损伤时,p53转译水平会升高,使细胞停滞于G1期进行DNA的修复,如果不能完成DNA的修复,可促使其走向凋亡[5]。病毒性心肌炎可导致心肌缺血再灌注,产生大量的氧自由基,对DNA造成损伤,p53蛋白表达增多,可下调Bcl-2基因,上调Bax基因,从而促进细胞凋亡[6]。

随着对IGF-1研究的逐步深入,人们发现IGF-1在调节凋亡方面起着重要作用[7-8]。牵张试验发现:将大鼠离体心肌预先用IGF-1处理后,与对照组相比,心肌牵张6、20h后细胞凋亡分别下降43%,61%[9]。Liu等[10]研究结果显示:在动物心肌梗死模型中予IGF-1,与对照组相比,4周后心肌细胞凋亡明显减少。IGF-1作为一种细胞凋亡的抑制调控因子,主要是通过与特异性的靶细胞表面受体结合而发挥功能。其抗凋亡的主要效应器路径为:IGF-1与受体结合后,PI3激酶被激活并磷酸化,导致前凋亡因子BAD的内聚,从而阻止了BAD与抗凋亡蛋白Bcl-2在线粒体膜上形成二聚体。Bcl-2的单体形式能与Bax的诱凋亡作用相拮抗,形成二聚体后即失去了抗凋亡的活性[11]。IGF-1抗凋亡路径的最终效应是抑制了凋亡蛋白Caspase[12]。本研究显示:感染组p53的表达增高,而在IGF-1治疗组,p53的表达明显下降,提示IGF-1通过抑制p53的表达来抑制凋亡。

随着IGF-1作用机制阐明,应用IGF-1治疗VMC可能将是一种有效的方法。目前IGF-1已探索性地用于治疗心肌细胞凋亡[13]。但其长期疗效和不良反应需进行更多的动物实验和临床研究来阐明。

[1]丁万宝,魏彩霞.p53促凋亡蛋白ASPP在恶性血液病中表达的研究进展[J].实用医学杂志,2006,22(5):602-603.

[2]郭俊芳,张赢予,陈 蓉.骨髓间充质干细胞旁分泌途径与阿霉素损伤心肌细胞凋亡:怎样证明其抑制效应 [J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(10):1755-1759.

[3]韩立波,汪淑英.IGF-1、PAPP-A在稳定性心绞痛及急性心肌梗死患者中的变化及意义[J].中外医疗,2010,29(7):42-44.

[4]Cheng W,Reiss K,Kajstura J,et al.Down-regulation of the IGF-1system parallels the attenuation in the proliferative capacity of rat ventricular myocytes during postnatal development[J].Lab Invest,2005,72(4):646-655.

[5]岳 剑,张忠明.NF-κB与p53蛋白在卵巢上皮肿瘤的表达及意义[J].陕西医学杂志,2011,40(3):262-264.

[6]应小平,王小平,王 君,等.人乳腺浸润性导管癌中p53、bcl-2、bax的基因表达[J].陕西医学杂志,2007,36(10):1302-1303.

[7]谢 洋,吴小涛.IGF-1、IGF-1R在人退行性变腰椎间盘中的表达及其生物学意义[J].东南大学学报(医学版),2010,29(2):148-152.

[8]谢 赛.IGF-1R在神经保护和大脑肿瘤中的作用[J].中国病理生理杂志,2009,25(5):897-897.

[9]Leri A,Liu Y,Claudio PP,et al.Insulin-like growth factor-1induces mdm 2and down-regulates p53,attenuating the myocyte rennin-angiotensin system and stretch-mediated apoptosis[J].Am J Pathol,2009,154(2):576-580.

[10]Liu TB,Fedak PWM,Weiseli RD,et al.Enhanced IGF-1 expression improves smooth muscle cell engraftment after cell transplantation[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,287(10):2840-2849.

[11]熊程凯,皮丽娟,邓成国.IGF-1对高糖诱导的小鼠早期胚胎凋亡的抑制作用[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2010,19(1):93-96.

[12]Herrler A,Krusche CA,Beier HM.Insulin and insulinlike growth factor I promote rabbit blastocyst development and prevent apoptosis[J].Biol Reprod Dev,2001,38(9):373-379.

[13]Khoynezhad A,Jalali Z,Tortolani AJ,et al.Apoptosis:Pathophysiology and therapeutic implications for the cardiac surgeon[J].Ann Thorac Surg,2004,78(3):1109-1118.

猜你喜欢

组织化学心肌细胞灰度
采用改进导重法的拓扑结构灰度单元过滤技术
左归降糖舒心方对糖尿病心肌病MKR鼠心肌细胞损伤和凋亡的影响
活血解毒方对缺氧/复氧所致心肌细胞凋亡的影响
食管鳞状细胞癌中FOXC2、E-cadherin和vimentin的免疫组织化学表达及其与血管生成拟态的关系
基于最大加权投影求解的彩色图像灰度化对比度保留算法
基于灰度线性建模的亚像素图像抖动量计算
心肌细胞慢性缺氧适应性反应的研究进展
大口黑鲈鳃黏液细胞的组织化学特征及5-HT免疫反应阳性细胞的分布
槲皮素通过抑制蛋白酶体活性减轻心肌细胞肥大
免疫组织化学和免疫荧光染色在肾活检组织石蜡切片磷脂酶A2受体检测中的应用