滋肾通络方含药血清对高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖的影响

孟凡荣 马建伟 赵宗江，3

(1大连医科大学，大连，116110;2空军总医院中医科，北京，100142;3北京中医药大学基础医学院，北京，100029)

DN是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一。糖尿病肾病肾小球硬化(Glomerulosclerosis，GS)是所有慢性肾脏疾病进行性发展至终末期的共同通道，最终可导致慢性肾功能衰竭。因此，早期治疗对于延缓或逆转GS以减少终末肾的发生有着重要的意义。从细胞水平上来看，系膜细胞(Mesangial Cell，MC)过度增殖及细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的过度生成和聚积是肾小球硬化早期的病理改变［1］。目前GS的西医防治措施较有限，因此，从中医药中寻找有效的防治药物将为延缓及治疗DN提供有效的途径。滋肾通络方是治疗DN临床疗效较好的经验方。我们以往的实验研究表明，该方对DN大鼠肾脏具有明显的保护作用［2－10］。本研究以高糖环境下系膜细胞增殖为模型，观察滋肾通络方对其增殖的影响，其目的在于进一步探讨该复方防治DN的机制。

1 实验材料

1.1 动物和GMC细胞株 SD雄性大鼠15只，SPF级，购自于北京华阜康生物股份有限责任公司。大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)株，购于上海坤肯生物化工有限公司(QK10144)。

1.2 仪器与试剂 超净工作台、恒温CO2培养箱、倒置相差显微镜、450型自动酶标仪(MuLtiskan Ascent)。胎牛血清(四季青Lot:No.061024)，RPMI－1640培养基 (GIBICOLot:No.663264)，MTT(SigmaLot:No.BS0881)，二甲基亚砜(DMSO)(AMRESCO公司:Lot:No.0231)，胰蛋白酶1∶250(Gibco Lot:No.41500－067);LPS(Sigma Lot:No.DH183－10);EDTA(Sigma Lot:No.40－3)。

1.3 药物 滋肾通络复方药材由北京市同仁堂提供;苯那普利胶囊:规格10 mg/片，为北京诺华制药公司产品，产品批号SD26003。

2 方法

2.1 含药血清的制备 将SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为5组，即正常组(给予同体积0.9%生理盐水)、苯那普利组(每日以1.16 mg/kg苯那普利灌胃)、滋肾通络方小剂量组(每日以38.5g/kg灌胃)、中剂量组(每日以19.25 g/kg灌胃)、大剂量组(每日以9.625g/kg灌胃)。1次/d，各组自由饮食，连续7 d，在末次灌胃2 h麻醉后，在无菌条件下经髂总动脉采血，静置2h，离心(3000 r/min，20 min)，分离血清，并将含药血清置于56℃水浴箱中，水浴30 min灭活补体处理。经0.22 μm滤器过滤除菌后分装并置于－20℃冰箱保存备用。

2.2 细胞复苏 1)从－70℃冰箱中取冻存有细胞的冻存管，手中快速搓动成冰水混合物;2)移入离心管后，加入不含有胎牛血清的1640量为10 mL，吹打后1000 r/min离心2 min，弃上清，如上清洗2次;3)加入10%胎牛血清的1640量为3 mL;4)吹打均匀后移入一新培养瓶，再加2 mL培养基;5)置于恒温CO2培养箱中。

2.3 细胞传代 待镜下观察细胞生长融合至80%时:1)用0.25%胰蛋白酶消化约2 min，镜下观察待细胞变圆脱壁后;2)用移液管吹打并转入离心管，1000 r/min离心2 min，弃上清;3)用含有10%胎牛血清1640吹打均匀后分装于新的培养瓶后置于温箱培养。

2.4 细胞分组与给药 取第3代GMC用含10%FBS的1640将细胞密度调整到1.2×105/mL，转种于96孔培养板中，25μL/孔，则每孔细胞数为3×103/个，再于每孔加入含10%FBS的1640量为175μL。37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养24 h后，各孔换液加入不含FBS的1640培养液200μL以同步各组细胞于G0期。然后分组:1)空白组:5%正常组含药血清+3%胎牛血清+1640;2)高糖 +LPS组:8%胎牛血清 +高糖(2.5mg/mL)+LPS(1μg/mL);3)苯那普利组:5%苯那普利组含药血清+3%胎牛血清+高糖(2.5mg/mL)+LPS(1μg/mL);4)滋肾通络方小剂量组:5%滋肾通络方小剂量组含药血清+3%胎牛血清+高糖(2.5mg/mL)+LPS(1μg/mL);5)滋肾通络方中剂量组:5%滋肾通络方中剂量组含药血清+3%胎牛血清+高糖(2.5mg/mL)+LPS(1μg/mL);6)滋肾通络方大剂量组:5%滋肾通络方大剂量组含药血清+3%胎牛血清+高糖(2.5mg/mL)+LPS(1μg/mL)，每组设10个复孔。

2.5 GMC增殖的实验 细胞培养12 h、24 h、48 h后分别取出相应的细胞板，吸出培养液，各孔加入10 μL浓度为5 mg/mL的MTT及190 μL无血清1640，37℃继续培养4 h，吸弃各孔培养液，每孔加入200 μL的LDMSO，室温避光，轻轻震荡10 min，使结晶充分溶解，在酶标仪上检测波长为490 nm的光密度值。

2.6 统计学方法 用SPSS 17.0软件进行数据分析。实验数据采用(±s)表示。统计学分析采用方差分析。

3 结果

3.1 GMCs细胞形态 在倒置显微镜下观察，可见正常组大鼠肾小球系膜细胞体积较大，且纯度极高，形态多为梭形或星形。见图1与图2为不同时期的细胞形态。

表1 各组含药血清对于高糖+LPS刺激的肾小球系膜细胞增殖的影响

图3 各组含药血清对于高糖+LPS刺激的肾小球系膜细胞不同时间点增殖的影响

3.2 MTT法结果 表1显示，高糖+LPS刺激后12h、24h及48h各时相点GMCs明显增殖，与空白组比较差异显著(P＜0.05)。苯那普利和滋肾通络复方含药血清对高糖+LPS诱导的GMCs增殖具有不同程度的抑制作用，在各个时间点与高糖+LPS组相比，P＜0.05。

4 讨论

DN是糖尿病最主要的并发症之一，是终末期肾衰的主要原因［11］。系膜细胞是肾小球固有细胞中最活跃的细胞，是产生细胞外基质、分泌细胞因子、吞噬和清除异物的主要细胞之一，系膜细胞对DN病理改变起着关键作用。系膜细胞异常增殖以及细胞外基质的增多是DN的基本病理变化，因此抑制GMCs增生，减少细胞外基质的堆积，已成为防治DN的重要环节之一。高血糖是DN的始动因素和中心环节［12］，以往的研究认为，高糖环境对MCs的生长具有双向性，在培养早期(24～48 h)高糖能促进MCs增殖，此后高糖对MCs增殖起抑制作用［13］。滋肾通络方含药血清和高糖共同培养MCs 12 h、24 h、48 h后，发现滋肾通络方含药血清对高糖诱导的MCs增殖具有明显的抑制作用。

DN属中医学“消渴病”继发的“水肿”“关格”等病证的范畴。尊师马建伟教授根据多年的临床经验及其实验研究［2－10］，结合吕仁和教授提出的“症瘕学说”［14］，认为早期的DN的基本病机为先天元气不足，肾气亏虚，肾虚气化无力，一方面气虚不能助血运行，血行不畅，另一方面是糖尿病出现肾脏病变一般病程较长，久病入络，久病必瘀，从而导致肾络瘀阻，久之肾络出现微型症瘕，肾脏功能进一步虚损。滋肾通络方应用益气滋肾、活血通络法治疗早期DN。其基本组成方药由黄芪、生地黄、菟丝子、山茱萸、淫羊藿、当归、红花、莪术、地龙、五味子、茯苓、萆薢组成。其中黄芪为君药，补益肾气。现代药理研究表明:黄芪可以通过降糖、调脂、调节内皮素与一氧化氮平衡、抗过氧化作用、抗蛋白非酶糖化作用等多种途径治疗糖尿病肾病［15］。生地黄、山茱萸、五味子益气滋阴，淫羊藿、菟丝子补肾益精，上药共为臣药。地黄为玄参科植物地黄的新鲜或干燥块根［16］，生地黄清热凉血、养阴、生津，有研究发现其调节血糖的主要成分是地黄寡糖［17］。佐以当归、红花、莪术、地龙活血化瘀通络;萆薢清泄肾浊、分清水湿;茯苓淡渗健脾，既有补肾固精之效，又可防脾土之壅滞。简言之，黄芪、生地黄、山茱萸等药物调动肾脏和全身的气血，恢复机体的功能状态，用当归、红花、莪术、地龙活血化瘀，疏通肾络的微循环通路，在益气滋肾的作用下，使肾络的微型症瘕得以消散。整体从肾气着手，局部从症瘕考虑，整体和局部相结合，调动全身启动局部，从而改善全身症状，恢复肾功能。本研究通过从细胞水平证实滋肾通络方的含药血清具有较好的抑制大鼠肾小球系膜细胞增殖的作用，这有可能是滋肾通络方防治糖尿病肾病，延缓其进展的机制之一。

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