异种抗原免疫及瘤内注射诱导淋巴细胞杀伤S180细胞的研究

司晓燕 高言宝

肿瘤免疫治疗是目前研究的热点之一，但由于肿瘤的低免疫原性和机体对肿瘤的低免疫反应性，使得免疫治疗受到限制。细胞毒T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性在机体抗肿瘤效应中起关键作用[1]。研究发现肿瘤微环境处于免疫抑制状态，树突状细胞(DC)不能有效地递呈抗原[2]，因而不能诱导CTL杀伤肿瘤细胞。细菌及其制剂是最早采用的非特异性免疫刺激剂，研究发现它们能激发和增强机体的特异与非特异免疫机能，达到抗肿瘤作用。血型抗原亦可引起很强的抗血型免疫反应，可能激发和增强机体的特异与非特异免疫机能。本研究是利用两种异种抗原(灭活链球菌和A型血型抗原)瘤内注射并配合全身免疫来治疗肿瘤，将抗细菌、抗血型免疫反应和二次免疫应答引入肿瘤局部，希望能够改善肿瘤局部的免疫抑制微环境，打破免疫耐受，使DC递呈肿瘤抗原，诱导CTL杀伤肿瘤细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 胎牛血清、RPMI1640培养液、PBS、小鼠红细胞裂解液及MTT试剂盒均购自普利莱基因技术有限公司。灭活链球菌粉剂(α-溶血性链球菌经60Co机照射24 h灭活)及人A型血型抗原由南方医科大学珠江医院肿瘤中心实验室提取。利用血型抗原免疫及瘤内注射来治疗肿瘤的实验方法已申请专利，专利号为200810029547.9。

1.1.2 实验动物及肿瘤细胞株 试验用动物为4～6周龄昆明种小鼠，体重18～20 g，雌雄兼用，购自南方医科大学动物实验中心。小鼠肉瘤S180细胞株由南方医科大学药学院惠赠。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组:昆明小鼠42只，每组6只，随机分为7组:①灭活链球菌全身免疫及瘤内注射组。②灭活链球菌仅全身免疫组。③灭活链球菌仅瘤内注射组;①A型血型抗原全身免疫及瘤内注射组。②A型血型抗原仅全身免疫组。③A型血型抗原仅瘤内注射组。④空白对照组。

1.2.2 小鼠实体瘤制作方法 先制作S180腹水型小鼠，再从小鼠腹腔无菌抽取癌腹水，制成癌细胞悬液，调整细胞浓度为1×107个/ml，取0.1 ml用于小鼠背部皮下接种以制作实体瘤模型，成瘤率近100%[3]。

1.2.3 造模过程 前两周用异种抗原全身免疫小鼠4次，2次/周(A、B组小鼠腹腔注射浓度为0.1 g/ml的灭活链球菌0.1 ml/只;a、b组小鼠腹腔注射浓度为5 mg/ml的A型血型抗原0.1 ml/只;同时C、c、D(d)组小鼠均腹腔注射生理盐水0.1 ml/只)。然后于7组小鼠背部皮下接种浓度为1×107个/ml的S180细胞0.1 ml/只，约两周长成大小为1 cm3左右的肿块，随后连续5 d瘤内注射异种抗原(A、C组小鼠瘤内注射浓度为0.1 g/ml的灭活链球菌0.1 ml/只/;a、c组小鼠瘤内注射浓度为5 mg/ml的A型血型抗原0.1 ml/只;同时B、b、D(d)组小鼠均瘤内注射生理盐水0.1 ml/只)。瘤内注射结束3 d后，处死小鼠。

1.2.4 小鼠脾淋巴细胞悬液的制备 参照文献[4]进行，为杀伤试验提供效应细胞。

1.2.5 靶细胞悬液的制备 常规培养小鼠肉瘤S180细胞，为杀伤实验提供靶细胞。

1.2.6 体外杀伤活性测定 用MTT比色法测定不同处理组小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的体外杀伤活性[5]。调整脾淋巴细胞浓度为2×106个/ml，S180细胞浓度为1×105个/ml，效应细胞:靶细胞(E∶T)=20∶1。取效应细胞和靶细胞各100ul加入到96孔板，5%CO2，37℃培养24 h后，加入5 mg/ml的 MTT 10ul，继续培养 4 h，1000r/min 离心 5 min，弃上清加150ul二甲基亚砜震荡，待蓝紫色沉淀溶解后，用酶联仪于波长570nm处测定，读取A值，同时设空白对照、靶细胞对照(T)、效应细胞对照(E)，每组均设三个复孔，取其均值，按下式计算杀伤活性:

2 结果

2.1 灭活链球菌实验4组小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤率见表1。经总体方差分析处理组间差异有显著性(F=366.675，P=0.000)。经多重比较，灭活链球菌全身免疫及瘤内注射组脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤活性显著高于灭活链球菌仅全身免疫组、灭活链球菌仅瘤内注射组和空白对照组(P=0.000，P=0.000和P=0.000);同时灭活链球菌仅瘤内注射组也高于灭活链球菌仅全身免疫组和空白对照组(P=0.000和P=0.000);而灭活链球菌仅全身免疫组和空白对照组却无显著性差异(P=1.000)。

表1 4组小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤活性(A值，±s)

表1 4组小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤活性(A值，±s)

小组 样本数 杀伤率(A)灭活链球菌全身免疫及瘤内注射组6 9.85%±2.76%6 63.17%±3.94%(B)灭活链球菌仅全身免疫组 6 10.26% ±1.95%(C)灭活链球菌仅瘤内注射组 6 33.30% ±3.82%(D)空白对照组

2.2 A型血型抗原实验4组小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤率见表2。经总体方差分析处理组间差异有显著性(F=437.790，P=0.000)。经多重比较，A型血型抗原全身免疫及瘤内注射组脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤活性显著高于A型血型抗原仅全身免疫组、A型血型抗原仅瘤内注射组和空白对照组(P=0.000，P=0.000和P=0.000);同时A型血型抗原仅瘤内注射组也高于A型血型抗原仅全身免疫组和空白对照组(P=0.000和P=0.000);而A型血型抗原仅全身免疫组和空白对照组却无显著性差异(P=1.000)。

表2 4组小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤活性(A值，±s)

表2 4组小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤活性(A值，±s)

6 9.85%±2.76%6 76.27%±4.07%(b)A型血型抗原仅全身免疫组 6 10.55% ±2.29%(c)A型血型抗原仅瘤内注射组 6 40.92%±4.98%(d)空白对照组小组 样本数 杀伤率(a)A型血型抗原全身免疫及瘤内注射组

2.3 两种异种抗原免疫及瘤内注射激活的小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤活性比较:经两样本t检验，A型血型抗原全身免疫及瘤内注射组的杀伤活性高于灭活链球菌全身免疫及瘤内注射组(t=5.662，P=0.000);A型血型抗原仅瘤内注射组的杀伤活性也高于灭活链球菌仅瘤内注射组(t=2.973，P=0.014)。

3 讨论

目前肿瘤免疫治疗研究的热点主要集中在抗癌效应细胞、细胞因子、抗癌抗体、瘤苗及基因治疗的各个方面。肿瘤抗原与免疫耐受是肿瘤免疫的两个最重要的主题，如何增强肿瘤细胞免疫原性及打破肿瘤免疫耐受状态，是设计肿瘤免疫治疗方案时首先要考虑的问题。抗肿瘤免疫效应一般以细胞免疫为主，尤其是细胞毒T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性在机体抗肿瘤效应中起关键作用[6]。肿瘤抗原的识别、加工、提呈及T淋巴细胞的致敏、激活依赖于抗原提呈细胞(APC)。树突状细胞(DC)是目前已知体内抗原呈递功能最强的APC[7]。研究发现肿瘤局部微环境处于免疫抑制状态，其内的细胞免疫亦存在着一个复杂的调节网络[8]。在肿瘤患者体内，DC处于失活状态，表现为数量减少及表型和功能上的缺陷[9]。由于DC的生物学功能是在体内迁移的过程中体现的，根据DC迁移的特点，可以通过介导肿瘤部位招募非成熟DC、激活肿瘤浸润树突状细胞(TIDC)和促进已摄取抗原的DC迁移至淋巴结，以激活CTL来提高肿瘤免疫治疗作用[10]。因此如何改善肿瘤局部的免疫抑制微环境，在肿瘤局部原位募集DC细胞、T细胞等免疫细胞，并使DC递呈肿瘤抗原，则能诱导CTL特异性杀伤肿瘤细胞活性。

19世纪末，William Coley便开始采用混合的细菌毒素(Coley毒素)来治疗恶性肿瘤，Coley毒素即是最早采用的非特异性免疫刺激剂，以后发展了多种非特异性免疫刺激剂，如卡介苗(BCG)、棒状杆菌等，尤其是BCG膀胱灌注治疗膀胱癌获得了成功[11]。一些细菌等非特异性免疫刺激剂依靠很强的抗原性，能激发和增强机体的特异与非特异免疫机能，达到抗肿瘤作用。同时血型抗原是一类具有很强的免疫原性和抗原性的同种异型抗原，将其于肿瘤局部注射也将激发机体很强的抗血型免疫反应。由于二次体液免疫应答具有高效、快速等特点，若将抗细菌、抗血型免疫反应和二次免疫应答引入肿瘤局部，则可能改善肿瘤局部免疫抑制状态，促进DC递呈肿瘤抗原，从而激发CTL特异性杀伤肿瘤细胞活性。

本实验是利用两种异种抗原(灭活链球菌和A型血型抗原)瘤内注射并配合全身免疫来治疗肿瘤，将抗细菌、抗血型免疫反应和二次免疫应答引入肿瘤局部，取得了较为理想的结果。异种抗原仅全身免疫组和空白对照组小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤作用很弱，主要是它的非特异性细胞毒作用所致。而异种抗原全身免疫及瘤内注射组的杀伤活性却很强，异种抗原仅瘤内注射组的杀伤活性也有所提高，其抗肿瘤免疫反应的机制可能有以下几个方面:①异种抗原与抗体结合，引起肿瘤局部炎症反应，产生大量细胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等，它们具有较强的抗肿瘤及免疫调节作用。②聚集Mф细胞、NK细胞、DC细胞和T细胞等非特异和特异性免疫效应细胞，NK细胞和Mф细胞可直接发挥抗肿瘤作用，同时IL-2等可增强其抗肿瘤作用[12]。③随着肿瘤细胞萎缩死亡，肿瘤抗原暴露，趋化到肿瘤局部的未成熟DC及TIDC识别肿瘤抗原，递呈肿瘤抗原给CD8+T细胞，CTL活化、增殖，杀伤肿瘤细胞。

经比较两种异种抗原激活的小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤活性，我们发现A型血型抗原的效果更好一些。血型抗原还具有取材方便、应用简单等特点。本实验的不足之处是没有检测肿瘤局部的相关免疫细胞、细胞因子，尤其是DC细胞的免疫状态，来验证其确实递呈了肿瘤抗原，激活了CTL，所以仍需更深入的研究本实验方法的机理，并完善此方法。

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