舒尼替尼联合多西他赛对A549细胞增殖、凋亡、细胞周期及c-met、mek、erk mRNA表达的影响

蔡 晶，韩 娜，张 芳，方 黎，郑鹏远，张中冕

郑州大学第二附属医院肿瘤科 郑州 450014

肺癌是目前全球最常见、对人类生命与健康危害最大的恶性肿瘤，发病率和死亡率均居恶性肿瘤首位，且发病率仍呈逐年上升的趋势。其中非小细胞肺癌约占肺癌总数的80%；70%～80%的非小细胞肺癌患者在确诊时已经是肺癌晚期，早期患者术后仍有30%～70%会发生局部复发或远处转移[1-2]。药物治疗目前仍是晚期肺癌治疗的重要手段之一，但是治疗结果仍不令人满意。因此，探索新的治疗方案是必要的。有临床研究[3-4]显示分子靶向药物联合化疗可进一步提高疗效。舒尼替尼是一种口服的小分子酪氨酸激酶抑制剂，具有强力的抗血管生成作用和抗肿瘤作用[3]。多西他赛是一种半合成的紫杉烷类抗癌药物，与β微管蛋白结合，可诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡[4]。在美国，多西他赛既可以单独应用，也可以与其他药物联合治疗实体瘤如肺癌、乳癌等[5]。该研究旨在探讨多西他赛和舒尼替尼单用或联用对人类非小细胞肺癌细胞株A549的影响。

1 材料与方法

1.1材料A549细胞株由郑州大学医学院提供。舒尼替尼购自Pfizer公司，多西他赛购自英国Aventis Pharma Dagenham公司，RPMI 1640培养液、2.5 g/L胰蛋白酶(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、Annexin V-FITC和PI凋亡检测试剂盒均购自美国Sigma公司，逆转录试剂盒(Fermentas公司)，引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司，EPICS-ALTRA 型流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)。

1.2实验分组常规培养A549细胞，用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(内含青霉素100 kU/L、链霉素100 mg/L)于37 ℃、体积分数5% CO2、饱和湿度条件下培养，每2～3 d换液传代 1 次。取对数生长期的A549细胞，以5×107L-1接种于 96 孔板，每孔100 μL。实验Ⅰ：两药同时给药对A549细胞的影响。待细胞贴壁后分4组处理。对照组加入RPMI 1640培养基；多西他赛单药组给予含多西他赛(终质量浓度16 mg/L，下同)的培养液；舒尼替尼单药组给予含舒尼替尼(终浓度7.5 μmol/L，下同)的培养液；舒尼替尼+多西他赛组给予含舒尼替尼和多西他赛的培养液。实验Ⅱ：两药不同顺序给药对A549细胞的影响。多西他赛→舒尼替尼组(D→S组)，先加入100 μL含多西他赛的培养液培养24 h，吸弃培养液后，再加入100 μL含舒尼替尼的培养液继续培养24 h。舒尼替尼→多西他赛组(S→D组)，先加入100 μL含舒尼替尼的培养液培养24 h，吸弃培养液后，再加入100 μL含多西他赛的培养液继续培养24 h。

1.3A549细胞增殖抑制率检测实验Ⅰ分组细胞按以上分组处理后分别继续培养24、48、72 h，每组设6个复孔，实验终止前4 h每孔加入5 g/L MTT 20 μL，置37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育4 h，终止培养，弃上清，每孔加入DMSO 200 μL，振荡10 min，在酶标仪上测定570 nm波长处的吸光度(A)，取均值。增殖抑制率=(空白对照孔A-实验孔A)/空白对照孔A×100%。实验Ⅱ分组细胞参照以上步骤处理。实验重复3次。

1.4A549细胞凋亡率检测实验Ⅰ分组细胞按以上分组处理后继续培养48 h后，吸除培养基，胰蛋白酶消化，悬浮液转移至离心管离心后，去上清，经吹打、收集、离心，冷PBS洗2次后，用1×结合缓冲液重悬细胞(细胞密度1×109L-1)。取100 μL重悬液，加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,轻轻混匀,室温暗室孵育15 min。每管加400 μL 1×结合缓冲液，1 h内上流式细胞仪,检测细胞凋亡 (包括早期、晚期和总凋亡率)。同时记录细胞周期分布。实验Ⅱ分组细胞参照以上步骤处理。实验重复3次。

1.5A549细胞中c-met、mek、erkmRNA的表达水平检测实验Ⅰ分组细胞按以上分组处理后继续培养48 h后收集细胞，按Trizol 试剂盒说明提取总RNA，逆转录合成cDNA。实验所用引物如下。c-met：上游引物为5’-GGTTTTTCCTGTGGCTGAAA-3’，下游引物为5’-CACAACCAAAATGCCCTCTT-3’，目的基因426 bp； mek：上游引物为5’-CCTTGAGGC CTTTCTTACCC-3’，下游引物为5’-ATGTTG GAGGGCTTGACATC-3’，目的基因441 bp；erk：上游引物为5’-CCAGACCATGATCACACAGG-3’，下游引物为5’-CTCGTCACTCGGGTCGTAAT-3’，目的基因441 bp；β-actin：上游引物为5’-TGACGTGGACATC CGCAAAG-3’, 下游引物为5’-CTGGAAGGTGGA CAGCGAGG-3’，目的基因205 bp。扩增条件：95 ℃预变性5 min；95、57和72 ℃各30 s，35个循环(β-actin为30个循环)；72 ℃延伸10 min。取5 μL扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，用紫外线投射仪观察电泳条带，并用凝胶图像分析系统进行半定量分析，以目的条带和β-actin条带灰度的比值作为该基因mRNA的相对表达量。实验Ⅱ分组细胞参考以上步骤处理。实验重复3次。

1.6统计学处理采用SPSS 18.0处理数据。采用析因设计的方差分析比较舒尼替尼和多西他赛单药给药及二者联合给药时细胞增殖抑制率、凋亡率、细胞周期及3个基因mRNA表达水平的差异，采用两独立样本的t检验比较舒尼替尼和多西他赛不同顺序给药对以上指标的影响，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1舒尼替尼和多西他赛单药及联合给药对A549细胞增殖的影响见表1。结果显示，相对于单独用药，多西他赛、舒尼替尼联合用药抑制了细胞增殖，且呈时间依赖性。

表1 舒尼替尼和多西他赛单药及联合给药不同时间A549细胞的增殖抑制率(n=3) %

F多西他赛=17 228.952，F舒尼替尼=17 171.938，F时间=5 048.055，F交互=352.276，F多西他赛×舒尼替尼=6 019.386，P均<0.001。

2.2舒尼替尼和多西他赛单药及联合给药对A549细胞凋亡和细胞周期的影响见表2、3。结果显示，多西他赛、舒尼替尼联合用药较单独用药A549细胞晚期凋亡率及总凋亡率均增加，S期细胞减少。

表2 舒尼替尼和多西他赛单药及联合给药48 h对A549细胞凋亡的影响(n=3) %

表3 舒尼替尼和多西他赛单药及联合给药48 h对A549细胞细胞周期的影响(n=3) %

2.3舒尼替尼和多西他赛单药及联合给药对A549细胞3个基因mRNA表达水平的影响见表4。结果显示用药后c-met、mek mRNA表达下调，erk mRNA表达上调；联合用药时erk mRNA表达上调，优于单独用药。

表4 舒尼替尼和多西他赛单药及联合给药48 h后3个基因mRNA表达水平(n=3)

2.4舒尼替尼和多西他赛不同顺序给药对A549细胞增殖的影响D→S组细胞增殖抑制率为(81.563±0.628)%，高于S→D组的(64.126±1.600)%(t=13.554,P=0.005)。

2.5舒尼替尼和多西他赛不同顺序给药对A549细胞凋亡及细胞周期的影响见表5、6。结果显示D→S组与S→D组早期、晚期及总凋亡率均有差异；D→S组较S→D组G2/M期、S期细胞增多，G0/G1期细胞减少。

2.6舒尼替尼和多西他赛不同顺序给药对A549

细胞c-met、mek、erkmRNA表达水平的影响见表7。结果显示D→S组较S→D组c-met、mek mRNA表达水平下调，erk mRNA表达水平上调。

表5 舒尼替尼和多西他赛不同顺序给药对A549细胞凋亡的影响(n=3) %

表6 舒尼替尼和多西他赛不同顺序给药对A549细胞细胞周期的影响(n=3) %

表7 舒尼替尼和多西他赛不同顺序给药对3个基因mRNA表达水平的影响(n=3)

3 讨论

舒尼替尼是一种多靶点的酪氨酸激酶抑制剂,能同时抑制多条信号传导通路，具有抗肿瘤生长和抗血管生成作用，最终影响恶性肿瘤的生长、增殖和转移。多西他赛是一种紫杉烷类化合物。多西紫杉醇已被证明能够在体外抑制血管内皮细胞生长和毛细血管的形成，且呈剂量依赖性[6]。

该研究结果显示舒尼替尼与多西他赛均能诱导A549的凋亡。MTT法检测结果显示，不同的给药组合和次序对A549细胞增殖的影响不同，其中联合用药对细胞增殖的抑制作用大于单独用药，不同顺序给药中D→S方式优于S→D方式。

流式细胞术分析结果显示：舒尼替尼和多西他赛对于细胞凋亡和细胞周期的影响不同，联合用药诱导的晚期及总凋亡率均高于单药，且S期细胞减少；D→S方式诱导的早期凋亡率高于S→D方式，晚期和总凋亡率也有所差异。细胞周期分析则显示与S→D方式比较，D→S方式作用后，细胞多阻滞于G2/M期、S期，G0/G1期细胞减少。

c-met为肝细胞生长因子受体，具有酪氨酸激酶活性，与多种癌基因产物和调节蛋白相关，参与细胞信号传导、细胞骨架重排的调控，是细胞增殖、分化和运动的重要因素。c-met/ras/raf/mek/erk信号通路是一个小GTP结合蛋白连接活化的受体酪氨酸激酶和胞质蛋白激酶的级联反应，是众多MAPK通路中的一个。MAPK通路的核心包括3种蛋白激酶：①MAP-KKK是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，raf为重要的一员。②MAPKK具有磷酸化苏/酪氨酸残基的双特异功能，mek为重要的一员。③MAPK是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，erk为重要的一员。受体酪氨酸激酶发生羧基端过度磷酸化，刺激ras-GDP转换为ras-GTP，从而导致ras激酶过度活化[7-8]，活化的raf 进一步磷酸化激活mek，活化的mek激活erk，最后活化的erk激活或失活多种靶蛋白。c-met/ras/raf/mek/erk持续激活，最终导致异常细胞增殖及肿瘤形成。

RT-PCR结果显示，与S→D方式比较，D→S方式作用后，细胞c-met、mek mRNA表达水平明显下调，erk表达水平明显上调。推测多西他赛先激活下游信号erk，使之磷酸化[9-10]，随之舒尼替尼抑制这些信号，从而增加了细胞对舒尼替尼的敏感性。

总之，舒尼替尼和多西他赛能够抑制A549细胞增殖，诱导A549细胞凋亡，二药联用有交互作用；二药不同顺序给药时，D→S优于S→D的给药方式。以上结果显示，靶向药物与化疗存在最佳的给药顺序，先化疗后给予靶向药物可能会获得更好的临床效果。然而，舒尼替尼作为一种多靶点的药物，抗肿瘤机制复杂。该研究尚未探索舒尼替尼与多西他赛不同顺序给药对实体瘤的影响，今后仍需开展更加深入的研究。

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