粉防己碱对EC9706细胞增殖、细胞周期及sPLA2-Ⅱa蛋白表达的影响

段 昱，吕 品，贺付成，赵 雪

郑州大学第一附属医院检验科 郑州 450052

磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)是一类参与脂类代谢和调节的酶类。哺乳动物体内的sPLA2包括十余种亚型，分泌型PLA2-Ⅱa(secretory PLA2-Ⅱa, sPLA2-Ⅱa)是PLA2超家族成员之一[1]。前期研究[2]已表明sPLA2-Ⅱa蛋白及mRNA在食管鳞癌组织中表达升高，可能参与了食管癌的发生。粉防己碱(tetrandrine，Tet)是从中草药粉防己的根块中提取的一种生物碱，又名汉防己甲素。研究[3-4]发现Tet可抑制包括PLA2在内的多种酶类的活性，并且具有一定的抗癌作用。作者采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)、流式细胞术及免疫细胞化学SP法检测Tet对食管鳞状细胞癌EC9706细胞增殖、细胞周期及sPLA2-Ⅱa蛋白表达的影响，探讨Tet抑制食管癌细胞增殖的相关作用机制。

1 材料与方法

1.1材料EC9706细胞系由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠。Tet、二甲基亚砜(DMSO)及MTT均购自Sigma公司。RPMI 1640细胞培养液购自美国Gibco公司。胎牛血清为杭州四季青公司产品。兔抗人sPLA2-Ⅱa多克隆抗体购自香港ABCAM公司。免疫细胞化学SP试剂盒购自美国ZYMED公司。Tet用DMSO助溶，然后配成100 μmol/L储存液，存于4 ℃冰箱，使用时用RPMI 1640培养液稀释至15 μmol/L。

1.2细胞培养EC9706细胞单层贴壁培养于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，2～3 d换液一次，胰蛋白酶常规消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.3细胞增殖抑制率的MTT法检测取对数生长期细胞，调整细胞密度为6×104mL-1，按每孔0.2 mL接种于96孔培养板中，共接种60孔。培养24 h后，分4组处理。实验组分别用Tet作用细胞1、3和5 d，对照组不作任何处理，每组设15个复孔。加入MTT 20 μL，继续孵育4 h后，每孔加100 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，于酶标仪上测定波长492 nm处各孔的吸光度值，计算细胞增殖抑制率。

1.4细胞周期检测细胞同1.3中分组处理，每组设7个复孔，收集细胞，胰蛋白酶消化，离心、弃上清，用PBS洗2遍，加入体积分数70%乙醇，4 ℃保存。细胞染色前用PBS洗2遍，细胞沉淀重悬于500 μL PBS中(包含PI 50 mg/L，RNaseA 100 mg/L)，避光染色30 min，细胞经300目尼龙网过滤，流式细胞仪测定细胞周期分布。

1.5sPLA2-Ⅱa蛋白表达的免疫细胞化学检测取对数生长期的EC9706细胞于24孔培养板中，用15 μmol/L的Tet于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，1、3和5 d后取出细胞爬片(Tet作用1、3和5 d组)，以不作处理的EC9706细胞为对照组，pH 7.4 PBS冲洗，体积分数80%的丙酮固定30 min后，4 ℃冰箱保存，用于免疫细胞化学检测。一抗兔抗人sPLA2-Ⅱa多克隆抗体按1150稀释，PBS代替一抗作为阴性对照。所有爬片经高压抗原修复，其余步骤按免疫细胞化学SP试剂盒说明书操作，DAB显色，苏木素复染，以高清图像处理系统测定着色细胞的灰度值，评定sPLA2-Ⅱa蛋白表达的强弱。每组均设5个平行对照。

1.6统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，应用单因素方差分析和SNK-q检验比较各组细胞增殖抑制率、细胞周期及sPLA2-Ⅱa蛋白表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1Tet对EC9706细胞增殖和细胞周期的影响见表1。MTT检测结果显示，经Tet作用1、3和5 d后细胞增殖抑制率依次增高。细胞周期检测显示，Tet作用组G0/G1期细胞比例高于对照组，而S、G2/M期细胞比例低于对照组(P<0.05)。

表1 Tet对EC9706细胞增殖、细胞周期和sPLA2-Ⅱa蛋白表达的影响

除G2/M期Tet作用3 d组与5 d组差异无统计学意义外，其余各组两两比较P均<0.05。

2.2Tet对EC9706细胞sPLA2-Ⅱa蛋白表达的影响见图1、表1。sPLA2-Ⅱa蛋白免疫细胞化学染色阳性着色呈棕黄色，位于胞质。与对照组比较，Tet作用不同时间后细胞着色无明显改变，各组sPLA2-Ⅱa蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 各组细胞中sPLA2-Ⅱa蛋白的表达(SP,×200)

3 讨论

Tet是千金藤属防己科植物粉防己的主要活性成分，其化学结构属双苄基异喹啉类。作为一种钙离子拮抗剂，其消炎镇痛作用已为人们所熟知。近年来，众多研究[5-8]表明其在抑制肿瘤细胞增殖和放、化疗增敏上也发挥重要作用。

PLA2在自然界中分布较广泛，可催化水解甘油磷脂的酰基酯键。根据PLA2在组织内的分布、氨基酸序列同源性及生化功能等特征可将其分为分泌型、胞质型和非钙离子依赖型[9]。sPLA2-Ⅱa是PLA2家族成员之一，研究[4，10-12]表明其在食管癌、肺癌、乳癌、前列腺癌等癌组织中均呈高表达，sPLA2-Ⅱa基因还可促进大肠癌细胞系的增殖，并参与肿瘤的发生和免疫。Dong等[13]研究发现sPLA2-Ⅱa的作用可能与HER/HER2-PI3K-Akt-NF-κB信号通路的激活有关，高表达的sPLA2-Ⅱa促进了癌细胞的生长。

作者采用MTT法、流式细胞术和免疫细胞化学SP法检测了Tet作用于EC9706细胞后，细胞增殖、细胞周期及sPLA2-Ⅱa蛋白表达的变化，结果表明Tet能够显著抑制EC9706细胞的增殖。Tet作用于食管癌细胞后，细胞周期发生了G1→S期阻滞，但sPLA2-Ⅱa蛋白的表达差异无统计学意义。

Tet与一般的细胞毒性化疗药物相比，毒副作用小，对肝肾功能无损害且无骨髓抑制，是一种有效且较安全的抗癌药物。虽然Tet对EC9706细胞中sPLA2-Ⅱa蛋白的表达无影响，但作为酶抑制剂，Tet是否通过对sPLA2-Ⅱa酶活性的抑制来阻碍食管癌细胞的增殖以及Tet是否还存在其他抗癌机制值得深入研究。

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