激光辅助孵化对冷冻胚胎移植和新鲜胚胎移植患者临床妊娠结局的影响

张建瑞，管一春，章露文，郝大勇，刘 景，张彩霞，耿爱华，王兴玲#

1)郑州大学第三附属医院生殖医学中心 郑州 450052 2)郑州人民医院营养科 郑州 450052

透明带是包绕在哺乳动物卵子和胚胎外围的糖蛋白基质层，由糖蛋白、糖类、透明带特异蛋白组成。它可在受精过程中作为精子识别受体促进精卵结合并防止发生多精受精[1]。受精后透明带自然变硬，随着胚胎细胞的分裂以及囊胚的形成，在胚胎内部压力的作用下，透明带开始变薄直至破裂，随之囊胚孵出。在体外培养条件下，培养时间延长、培养过程中缺少细胞溶解素，均会造成胚胎透明带硬化，胚胎孵出困难[2]。辅助孵化是消减透明带厚度帮助胚胎从透明带中孵出的技术，主要采用机械、化学或激光等方法将透明带打孔或削薄。现有研究[3]表明,激光辅助孵化法(Laser assisted hatching, LAH)是一种简便、快速、安全的方法。 作者回顾性分析了LAH对冷冻胚胎移植及新鲜胚胎移植临床妊娠结局的影响,旨在探讨LAH在辅助生殖技术中的临床意义。

1 对象与方法

1.1研究对象收集2010年12月至2012年4月在郑州大学第三附属医院生殖医学中心接受辅助生殖技术治疗的患者(645个周期)。①冷冻胚胎移植：患者年龄<35岁，透明带厚度<15 μm，行常规体外受精(in vitro fertilization, IVF)或卵细胞单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)，失败<2次，基础FSH值<15 IU/mL，新鲜周期取消移植并且为第1次冷冻复苏周期；按照是否行LAH分为LAH组与对照组，LAH组152个周期，对照组32个周期。②新鲜周期移植：患者为新鲜周期移植，透明带厚度<15 μm，IVF+ICSI失败<2次，基础FSH值<15 IU/mL；根据年龄是否≥35岁和是否行LAH分组，年龄<35岁行LAH共36个周期，不行LAH 333个周期；年龄≥35岁行LAH 70个周期，不行LAH 22个周期。患者均在知情同意后行LAH。研究获得该院伦理委员会的同意。

1.2促排卵方案促排卵方案按照患者自身情况采用短方案、长方案或者超长方案,阴道B超见到2个主导卵泡直径≥20 mm或者4个卵泡直径≥16 mm时肌内注射人绒毛膜促性腺激素(5 000 IU/支，中国广东丽珠医药集团股份有限公司)10 000 IU, 36～38 h后在阴道超声指引下行穿刺取卵术,取卵后根据适应证和精液情况行IVF或ICSI。受精后第1～3天观察胚胎发育情况。胚胎评级标准按文献[4]方法进行。年龄<35岁并且第1移植周期的患者移植或冷冻2个胚胎；年龄≥35岁或≥2个移植周期，移植或冷冻3个胚胎。胚胎移植后未妊娠的患者，调养2个月后再行冷冻胚胎移植。

1.3胚胎玻璃化冷冻复苏玻璃化冷冻试剂采用Medicult公司的Embryo Vitri System。首先将胚胎移入1液中1 min，然后转入2液3～5 min，最后转入3液中30 s，迅速放入冷冻麦管投入液氮，操作均在室温下进行。玻璃化冷冻复苏均采用Medicult公司的Embryo Warming System。复苏时迅速将冷冻麦管胚胎端置于1液中1 min(37 ℃)，依次移入2液、3液、4液中各3 min(室温)，最后将胚胎移入G-2培养液，放于37 ℃、体积分数6%CO2培养箱中。复苏后成活卵裂球数≥50%的胚胎为胚胎复苏存活。

1.4LAH倒置显微镜安装OCTAX激光系统。将含有胚胎的微滴放在倒置显微镜视野正中央，选取卵周间隙最大部位或碎片较集中区域进行LAH，连续将透明带自外向内削薄50%～80%，宽度相当于透明带周长的25%。

1.5胚胎移植胚胎移植及内膜准备按文献[5]方法进行。

1.6随访移植后随访按文献[6]方法进行。

1.7统计学处理用SPSS 17.0处理数据。定量资料采用t检验, 定性资料采用χ2检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1LAH对冷冻胚胎移植患者的影响2组患者的年龄、不孕年限、不孕类型、内膜厚度、移植胚胎数、复苏率差异均无统计学意义(P>0.05)。LAH组的临床妊娠率、多胎率、种植率均高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 冷冻胚胎移植LAH组与对照组各指标比较

2.2LAH对新鲜胚胎移植患者的影响年龄<35岁的患者中，LAH组与对照组各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。年龄≥35岁的患者中，2组年龄、不孕年限、不孕类型、内膜厚度、移植胚胎数、多胎率和流产率差异均无统计学意义(P>0.05)，但LAH组的临床妊娠率和种植率均高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 新鲜胚胎移植LAH组与对照组各指标比较

3 讨论

辅助生殖技术的成功受多种因素的影响。在辅助生殖技术中体外培养环境、患者的年龄及基础内分泌、胚胎的冷冻复苏都可能导致胚胎孵出困难，从而导致不能着床，这也是辅助生殖领域种植率和妊娠率低的重要原因之一[7-8]。近年随着现代技术的发展，LAH作为新技术被应用到辅助生殖技术中，从而达到削弱透明带的作用[9]。LAH具有快捷、简单、易于控制的优点，目前已成为许多中心的常规辅助孵化法。关于LAH的研究报道也很多,但是许多研究仅仅着手于辅助孵化的单一指征，并未排除其他影响因素，该研究尝试剔除影响辅助孵化的其他影响因素，分析LAH对冷冻胚胎移植及新鲜胚胎移植的影响。在冷冻胚胎移植患者中，作者选取患者年龄<35岁、透明带厚度<15 μm、IVF+ICSI失败<2次、基础FSH值<15 IU/mL及新鲜周期取消移植并且为第1次冷冻复苏周期的患者，排除了年龄、透明带厚度、重复失败及基础FSH的影响。研究结果显示，在年龄、不孕年限、不孕类型和内膜厚度无差异的情况下，LAH并未提高冷冻胚胎患者的临床妊娠率、多胎率和种植率，与Ng等[10-11]的结果一致，因此认为对冷冻胚胎移植患者不必常规行LAH。而谷瑞环等[7，12-13]的结果显示LAH有助于提高冷冻胚胎移植患者的妊娠结局，这种差异可能是研究对象的基本情况、胚胎质量的不同造成的。

对于新鲜胚胎移植患者，作者首先将患者按照年龄分为≥35岁组和<35岁组，选取了新鲜周期移植、透明带厚度<15 μm、IVF+ICSI失败<2次及基础FSH值<15 IU/mL的患者，排除了冷冻胚胎、透明带厚度、重复失败及基础FSH的影响。研究结果显示，在年龄、不孕年限、不孕类型、内膜厚度及移植胚胎数无差异的情况下，<35岁的LAH患者的临床妊娠率、多胎率、流产率和种植率与对照组比较，差异并无统计学意义，与Rufas-Sapir等[14]的结果一致，提示LAH并未提高年轻患者的妊娠率；但≥35岁的LAH患者的临床妊娠率和种植率均高于对照组，与张琪瑶等[15]的研究结果一致。可能原因为高龄患者透明带的薄化能力减弱，透明带变硬，使胚胎的孵出困难，导致着床失败。

综上所述，LAH并不是对所有患者都有效，仅在一定程度上对高龄新鲜胚胎移植患者有助于提高其妊娠率和种植率。但是激光打孔时,激光热效应不可避免地会对卵裂球产生一定的影响，另外LAH后的单卵双胎率升高，提高了患者围产期、分娩期的危险[16]，这就要求临床医生在实际工作中应严格掌握LAH的指征，尽量避免不必要的辅助孵化。

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