哮喘患儿外周血髓系抑制细胞、IL-10和IL-12水平检测*

张艳丽，王秀芳，乔俊英，雷瑞瑞，宋 丽，刘 莹

郑州大学第三附属医院儿内科 郑州 450052

哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，严重危害儿童的身心健康。其发病机制尚不十分清楚，但细胞因子在该病中的作用已受到国内外学者越来越多的关注。近年来，白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)和白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)作为Th细胞分泌的重要细胞因子，在哮喘发病中的作用越来越受到重视[1]。另外，国外对哮喘动物模型的研究[2]表明免疫细胞与哮喘相关，但机制不明。髓系抑制细胞(myeloid derived suppressor cells, MDSCs)是起源于骨髓、CD11b+CD33+的抑制性细胞，在重症感染、肿瘤、急慢性炎症等患者中明显增多，并且负向调节机体的免疫功能[3-4]。关于MDSCs与儿童哮喘之间的关系国内外尚无报道。该研究通过检测哮喘患儿外周血MDSCs和血清IL-10及IL-12的水平，探讨它们在儿童哮喘发病中的作用。

1 对象与方法

1.1研究对象选择2011年1月至2012年4月在郑州大学第三附属医院儿内科门诊就诊或住院治疗的急性发作期哮喘患儿52例为哮喘发作组，其中男28例，女24例，年龄1.9～4.9(3.1±1.1)岁；选择同期的哮喘缓解期患儿50例为哮喘缓解组，其中男26例，女24例，年龄1.8～4.7(2.9±0.9)岁；诊断均参照《全球哮喘防治创议》中的哮喘诊断标准[5]。选择同期在该院儿童保健部健康体检儿童48例为正常对照组, 其中男26例，女22例，年龄2.2～5.0(2.9±0.9)岁；45例同期在该院儿内科住院的肺炎患儿为肺炎对照组，其中男24例，女21例，年龄1.9～4.9(2.8±0.8)岁。均获得入选患儿家长书面知情同意，并征得医院医学伦理委员会的同意。

1.2外周血MDSCs的检测取抗凝血30 μL，加入上机管中，避光条件下分别加入CD11b+、CD33+标记的抗体各3 μL，振荡，混匀，管底部插入冰中避光孵育20 min，然后取出，加入红细胞裂解液1 mL，振荡后避光裂解15 min，离心，弃上清，加入PBS液1 mL，振荡，混匀，再离心，弃上清，加入PBS液1 mL，振荡，混匀，再离心，弃上清，加入40 g/L多聚甲醛300 μL，振荡，混匀，4 ℃冰箱保存，1周内上流式细胞仪检测。采用两色荧光标记技术流式细胞仪进行测定，分析采用CELLQuest软件，用FSC/SSC设门，画出有核细胞群(R1)，以去除死细胞及细胞碎片，二维点图显示R1内细胞，右上显示CD11b+/CD33+二维点图。结果以MDSCs占单个核细胞的比例表示。

1.3血清IL-10、IL-12的检测受试者于就诊第1天或入院第1天空腹采集股静脉血3 mL，立即置于不加任何抗凝剂的干燥试管内，于水浴箱37 ℃水浴1 h后，3 000 r/min离心10 min，迅速、小心地分离出血清置于无菌EP管内，放置-70 ℃冰箱保存，以待检测血清IL-10、IL-12水平。 IL-10、IL-12的测定采用双抗体夹心ELISA法(ELISA试剂盒购自美国R & D公司)，操作严格按照说明书的步骤进行。

1.4统计学处理采用SPSS 17.0进行分析。各组间MDSCs、IL-10及IL-12水平的比较应用单因素方差分析，组间两两比较应用SNK-q检验；哮喘发作组MDSCs与IL-10、IL-12的关系应用Pearson积差相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组儿童外周血MDSCs、血清IL-10及IL-12水平比较结果见表1。

表1 各组外周血MDSCs、血清IL-10及IL-12水平比较

*：与其他3组比较，P均<0.05。

2.2哮喘发作组患儿外周血MDSCs与IL-10、IL-10的相关性相关分析结果显示，哮喘发作组患儿外周血MDSCs与IL-10呈正相关(r=0.741，P=0.007)，与IL-12呈负相关(r=-0.879，P=0.014)。

3 讨论

TH1/TH2 平衡理论作为过敏性疾病如支气管哮喘发病机制中的核心已为大多数人所接受。IL-12是最重要的Th1型细胞因子之一，是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁，在机体抗感染免疫及炎症过程中起着重要的调节作用[2]。IL-10主要是由单核巨噬细胞产生的一种具有多面性生物活性的强免疫抑制因子，它可以抑制多种细胞合成相关细胞因子，改变机体的免疫应答和MHCⅡ类抗原的表达。IL-10在哮喘中的作用存在争议。MDSCs可负向调节机体的免疫功能[3]，它可诱导调节性T细胞(Tregs)间接影响T细胞的激活，Tregs可以下调细胞介导的免疫反应。基于上述机制，作者推测MDSCs在患儿哮喘过程中也起到重要的作用。

国外学者Grissell等[6]研究表明病毒感染诱发的哮喘，IL-10呈高表达状态。该结果显示，哮喘发作组较其他3组血清IL-10水平显著升高，与上述报道相一致。

IL-12在哮喘发病中起重要作用，并且其基因多态性与哮喘发病的危险指数相关[7]。周洋等[8]研究发现动态测定IL-12水平是判断支气管哮喘病情变化的有益指标，这与该研究发现的哮喘发作组与其他3组相比，血清IL-12水平显著降低相一致。

Poe等[9]研究表明患细菌性肺炎的小鼠中MDSCs样细胞和肺IL-10水平增加，这与该研究中肺炎对照组外周血MDSCs水平、血清IL-10水平无明显增加相反，推测可能与该研究对象为人相关。Kosaka等[10]研究表明细胞因子IL-10在MDSCs的产生和调节方面起重要作用；国外学者Kao等[11]发现MDSCs通过下调巨噬细胞分泌的IL-12水平发挥抑制作用，Bunt等[12]研究显示剧烈炎症可诱导MDSC产生高水平的IL-10，其诱导巨噬细胞分泌IL-12的减少依赖于MDSCs产生较多的IL-10。这与该研究发现MDSCs与IL-10呈正相关，与IL-12呈负相关相一致。因此推测MDSCs和巨噬细胞的相互作用引起IL-10的显著升高和IL-12的降低促进了哮喘慢性炎症的发展。MDSCs可能成为哮喘治疗的新靶点，至于MDSCs在哮喘发病过程中更确切的机制及治疗应用尚待进一步研究。

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