高血氨对大鼠血清胆红素及肝组织血红素加氧酶1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1表达的影响

王彦芳，阚全程#，余祖江，李朵璐，关克磊

1)郑州大学第一附属医院药学部 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院感染科 郑州 450052

肝脏是氨的主要代谢场所，血氨浓度增高与肝损害有关，主要表现为对神经系统和肝脏有很强的毒性[1]。Bhatia等[2]的研究发现动脉血氨浓度>124 μmol/L与重型肝性脑病和脑水肿发生相关。动物实验[3]证实胆红素可作为机体的抗氧化物质发挥极强的抗氧化作用。临床中发现血氨浓度与胆红素水平正相关，但氨致胆红素代谢紊乱的具体机制尚不清楚。目前，国内外关于氨引起星形胶质细胞代谢及形态改变的机制研究较多[4],但是关于氨对肝细胞的毒性，尤其是对肝脏中酶活性的影响研究甚少。作者针对临床上出现的高血氨合并高胆红素的现象，构建高血氨动物模型，观察氨对血清总胆红素(total bilirubin,TBIL)与直接胆红素(direct bilirubin,DBIL)水平、胆红素代谢相关的血红素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)和尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶1A1(UDP-glucuronosyltransferase 1A1, UGT1A1)的诱导作用及对核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路的影响，阐明氨对胆红素代谢的阻碍作用，以期为临床降氨药物的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂及仪器25只雄性清洁级Wistar大鼠购自郑州大学实验动物中心，合格证编号SCXK(豫)2005-0001，体质量180～230 g。NH4Cl(生工生物工程上海股份有限公司),Trizol Reagent(Invitrogen公司)，RevetAidTMFirst Strand cDNA合成试剂盒、DreamTap Green PCR Master Mix(Fermentas公司)，Rat TBIL ELISA 试剂盒(RD，CK-E91034R)，Rat DBIL ELISA 试剂盒(RD，CK-E91035R)，兔抗-HO-1/HSP32抗体(北京博奥森生物技术有限公司，bs-0827R)，鼠抗NF-κB P65抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司，sc-8008)，山羊血清封闭液(武汉博士德生物工程有限公司，AR0009)。PCR仪(S1000TMThermal Cycler，BIORAD)，DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)，荧光显微镜，德国蔡司公司；微量分光光度计NanoDrop 2000，Thermo科技公司，酶标仪，MultiskanMK3。

1.2高血氨大鼠模型的建立25只大鼠分为2组。高血氨组15只：每天早上8点和下午4点按100 mL/g给予100 g/L的NH4Cl灌胃；对照组10只，给予等量生理盐水；共灌胃4周。实验中高血氨组死亡3只。

1.3大鼠血清TBIL、DBIL水平测定采用ELISA法。每周心脏采血1次，3 000 r/min离心后取上清，96孔板每孔加上清10 μL、稀释液40 μL、HRP标记的抗体反应液50 μL，37 ℃温箱中孵育1 h。洗涤液洗板5次甩干，每孔加反应液A和B各50 μL，37 ℃温箱中孵育15 min，每孔加终止液100 μL，酶标仪上检测405 nm处的吸光度值，按标准曲线计算TBIL或DBIL的水平。

1.4大鼠肝组织HO-1和NF-κB的检测灌胃4周后心脏灌流摘取其肝脏，取部分用4 g/L的多聚甲醛固定。常规石蜡切片，脱蜡至水；pH 6.0柠檬酸修复抗原；滴加体积分数3%的H2O2封闭内源性过氧化物酶；山羊血清封闭内源性生物素。滴加一抗(兔抗-HO-1抗体按1400稀释；鼠抗NF-κB P65抗体按1300稀释)，4 ℃过夜；滴加二抗，50 μL/片，37 ℃ 30 min；滴加辣根酶标记卵霉链白素； DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下拍照。用Image-Pro Plus 6.0分析，以单位面积内阳性物质积分光密度值作为HO-1蛋白的相对表达量。NF-κB阳性细胞百分比的统计：每组计数5张图片中的100个细胞，计算阳性细胞百分比。

1.5大鼠肝组织UGT1A1mRNA的检测采用RT-PCR法。采用异硫氰酸胍一步法提取肝组织总RNA，逆转录合成cDNA。UGT1A1引物序列：上游5’-CCTCTCTGGAACAAAGCCACT-3’，下游 5’-AAG GCAGTTTATCCCACCAAT-3’，扩增产物大小为431 bp； GAPDH引物序列：上游5’-CAGTGCCAGC CTCGTCTCAT-3’，下游5’-AGGGGCCATCCA CAGTCTTC-3’ ,扩增产物大小为595 bp，由生工生物工程上海股份有限公司合成。反应总体系为25 μL：DreamTap Green PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，加双蒸水至25 μL。扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR 产物以20 g/L的琼脂糖凝胶电泳。以目的条带和GAPDH条带光密度值的比值作为UGT1A1 mRNA的相对表达量。

1.6统计学处理采用SAS 9.1处理数据。采用重复测量数据的方差分析比较2组大鼠不同时间点血清TBIL和DBIL水平，采用两独立样本的t检验比较处理4周后2组大鼠肝脏组织HO-1蛋白的相对表达量、NF-κB阳性细胞百分比及UGT1A1 mRNA的表达水平，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组大鼠血清TBIL与DBIL水平比较高血氨组TBIL和DBIL水平明显高于对照组，见表1、2。

表1 2组大鼠血清TBIL水平比较 μmol/L

F组间=201.524，F时间=446.552，F交互=89.223，P均<0.001。

表2 2组大鼠血清DBIL水平比较 μmol/L

F组间=131.864，F时间=455.413，F交互=57.882，P均<0.001。

2.2 2组大鼠肝组织HO-1和NF-κB的表达见图1。HO-1 阳性物质呈棕黄色，主要定位于胞质。高血氨组HO-1蛋白的相对表达量为(2 250.31±620.43)，较对照组的(156.66±10.28)上调(t=56.829，P<0.001)。NF-κB被激活后转移至胞核，胞核呈棕黄色者为阳性。高血氨组可见核内染色加深，阳性细胞百分比为(0.248±0.052)%，较对照组的(0.072±0.033)%增加(t=62.347，P<0.001)。

图1 2组大鼠肝组织HO-1和NF-κB的表达(SP，×400)

2.3 2组大鼠肝组织UGT1A1mRNA的表达RT-PCR结果见图2。高血氨组UGT1A1 mRNA的表达水平(0.611±0.152)高于对照组的(0.328±0.063)(t=6.449，P<0.001)。

图2 2组肝组织UGT1A1 mRNA的表达

3 讨论

HO-1是影响胆红素生成的关键酶，同时也是评估细胞氧化损伤的重要参考指标[5]。该实验中高血氨组大鼠肝组织HO-1的表达增强，预示着大鼠肝细胞已处于氧化应激状态。另有文献[6]报道在星形胶质细胞中NH4+介导的氧化压力导致HO-1过表达，而直接的氧化物清除剂牛磺酸和褪黑素可以有效抑制NH4+介导的HO-1过表达。NF-κB广泛存在于各种细胞中，通常与IκB 结合，使细胞中NF-κB 处于p50-p65-IκBβ多聚体的无活性状态，锚定在细胞质。当细胞受到细胞因子、脂多糖、氧自由基等刺激时，IκB发生磷酸化并迅速降解，激活的NF-κB向核内转移，调控相应基因的转录。近来研究[7]发现，NF-κB和MAPK通路可被活性氧激活，HO-1 的启动子区域含有NF-κB 结合位点，NF-κB 激活后可上调HO-1的表达。该实验中高血氨组大鼠肝组织出现NF-κB的核内转移增加并伴有HO-1的过表达，与上述研究相符。文献[7]也报道梗阻性黄疸发生时，肝脏中的NF-κB 被显著激活，出现核移位，体内产生大量的活性氧簇。而在星形胶质细胞中，NF-κB 的快速活化参与了胆红素所致的神经毒性损伤[8]。

胆红素是血红素的代谢产物，在肝脏微粒体UGT酶的催化下，间接胆红素转变为DBIL而排泄。其中UGT1A1 和UGT1A5被称为胆红素代谢群，尤其以UTG1A1的作用最明显[9]。生理水平的胆红素可以保护细胞膜抵抗脂质过氧化，其氧化能力甚至超过了维生素C和E[10]。已有实验[3]证明了胆红素对抗间二硝基苯所致的氧化应激作用，同时证明HO-1活力的升高在氧化应激时起到了提高胆红素水平的作用。该实验中，高血氨组大鼠经NH4Cl灌胃4周后，肝组织UGT1A1 mRNA的表达明显升高，推测可能是HO-1活力升高后提高UGT1A1底物(胆红素水平)的结果。而长期慢性HO-1上调释放的铁离子和CO会加重细胞氧化应激损伤，进一步导致胆红素水平的升高和UGT1A1的持续性高表达。诸多研究[9,11-12]也证实，UGT除了受孕烷X受体、组成型雄甾烷受体等孤儿核受体调节外，还与其底物胆红素有关。

该研究结果表明，大鼠经NH4Cl灌胃4周后，肝细胞已处于氧化应激状态，导致了NF-κB的核内转移增加，NF-κB 激活后上调HO-1的表达。HO-1的过表达是氨介导的氧化压力的结果，而UGT1A1的升高亦可能是HO-1活力升高后提高其底物(胆红素水平)的结果。但是有关HO-1对胆红素代谢及其代谢酶调控的详细机制还有待进一步阐明。

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