PDTC对A549细胞增殖、细胞周期、凋亡及星形细胞上调基因-1表达的影响

陈李影慧，吴武佳，秦东春

郑州大学第一附属医院检验科 郑州 450052

肺癌是目前世界范围内由癌症引起死亡的主要原因之一，其发病率和病死率逐年上升[1]。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)是一种NF-κB特异性抑制剂。近年来发现NF-κB有显著的促细胞生长及抗凋亡作用，与细胞恶性化的关系密切。通过抑制NF-κB的活化，间接下调相关下游基因表达，诱导肿瘤细胞凋亡是一种有效的肿瘤治疗方法[2-3]。新近发现，星形细胞上调基因-1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)过表达与肿瘤发生、发展及预后有密切关系[4]。作者观察了PDTC对人肺腺癌A549细胞增殖、细胞周期、凋亡及AEG-1表达的影响，探究PDTC对A549细胞增殖的抑制作用及可能机制，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1材料PDTC(纯度为99%, 批号P8765)购自Sigma公司，RPMI 1640培养基购自北京索莱宝公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶购自上海碧云天生物技术有限公司，DMSO、PI、Hoechst33342购自Sigma公司，MTT购自Biosharp公司，柱式Trizol总RNA抽提试剂盒及兔抗人AEG-1多克隆抗体(BBI)均购自上海生工生物工程有限公司，所需引物由上海生工生物工程有限公司合成，第一链合成试剂盒及2×Taq Green PCR Master Mix购自Fermentas公司，内参β-actin一抗和羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司，其他试剂均为国产分析纯。A549细胞由郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室惠赠。

1.2细胞培养A549细胞在含体积分数10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液中，37 ℃、体积分数5% CO2、饱和湿度条件下培养。

1.3体外细胞增殖抑制实验取对数生长期的A549细胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化，制成1×105L-1的单细胞悬液，接种于96孔板，每孔200 μL。弃上清，对照组加入培养液，PDTC组加入PDTC，使终浓度分别为25、50、100和200 μmol/L，每组设5个复孔，在细胞孵育24、48、72 h后每孔分别加入5 g/L的MTT溶液 20 μL，孵育4 h，弃上清，加100 μL的DMSO，置于微量振荡器上振荡5 min，混匀，用酶联免疫检测仪测波长492 nm处的吸光度(A)值，实验重复3次，取均值。细胞增殖抑制率=[1-(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)]×100%。以单纯加入DMSO为空白组。

1.4细胞周期检测取对数生长期的细胞，以(1～2)×105mL-1的浓度接种于6孔板，每孔1 800 μL，37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养24 h，每孔加入PDTC，使其终浓度分别为0(仅加入培养基)、25、50、100、200 μmol/L。培养24、48、72 h后，收集细胞，在PBS中吹打为单细胞悬液，体积分数70%冷乙醇固定，4 ℃过夜。1 000 r/min离心10 min弃乙醇，PBS洗2次，每管加入750 μL PI染液,室温避光染色30 min，流式细胞仪检测。

1.5细胞凋亡检测细胞按1.4分组处理24 h后，收集细胞，PBS清洗2次，胰蛋白酶消化，用含体积分数2%胎牛血清的培养基终止吹打成单细胞悬液，加入Hoechst33342至终浓度10 mg/L,37 ℃避光孵育30 min，制片，荧光显微镜下观察细胞核形态变化。

1.6AEG-1mRNA检测PDTC作用24 h后，Trizol法提取6孔板内各组细胞的总RNA。AEG-1上游引物：5’-AAATAGCCAGCCTATCAAGACTC-3’,下游引物：5’-TTCAGACTTGGTCTGTGAAGGAG-3’,扩增产物长度178 bp。内参β-actin上游引物：5’-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3’,下游引物：5’-TG GAAGGTGGACAGCGAGG-3’,扩增产物长度400 bp。按第一链合成试剂盒及2×Taq Green PCR Master Mix 的说明书进行逆转录和PCR扩增。反应体系：2×Master Mix(含染料)12.5 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物1 μL，ddH2O 9.5 μL，总25 μL。PCR扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55.2 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。15 g/L琼脂糖凝胶电泳，UVP凝胶图像分析仪扫描，目的条带与内参灰度值之比即为目的基因mRNA的相对表达量。

1.7AEG-1蛋白检测裂解PDTC作用24 h后各组细胞并提取总蛋白，分光光度计测定蛋白浓度，取50 μg样品蛋白分别经体积分数为3.5%浓缩胶和100 g/L SDS-PAGE凝胶电泳后，转至硝酸纤维素膜上。用含50 g/L脱脂奶粉的TBST液室温封闭1 h，然后置于用封闭液稀释的兔抗人AEG-1多克隆抗体(按1600稀释)和兔抗β-actin(按1400稀释)中，4 ℃过夜。TBST洗膜，加入羊抗兔二抗(按12 000稀释)摇晃孵育1.5 h，TBST洗膜后，ECL发光5 min，胶片曝光，结果扫入凝胶成像系统并分析。

1.8统计学处理采用SPSS 17.0处理数据。采用3×5析因设计的方差分析比较不同作用时间和不同浓度的PDTC作用24 h对A549细胞增殖的影响，采用单因素方差分析比较不同浓度的PDTC对A549细胞细胞周期、凋亡及AEG-1 mRNA和蛋白表达水平的影响，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1PDTC对A549细胞增殖的影响结果(表1)显示：PDTC在25～200 μmol/L范围内对A549细胞增殖具有明显抑制作用，且抑制作用呈剂量、时间依赖性。

2.2PDTC对A549细胞细胞周期的影响PDTC处理24 h后，G0/G1期细胞比例升高，S期及G2/M期细胞比例降低。见表2。

2.3PDTC对A549细胞凋亡的影响A549细胞经不同浓度PDTC作用24 h后，Hoechst 33342染色见典型的细胞核凝聚特征并出现凋亡小体；对照组细胞染色后无此特征。见图1。

表1 不同浓度PDTC作用不同时间A549细胞的增殖抑制率 %

F时间=531.981，F浓度=388.475，F交互=9.010，P均<0.001。

表2 PDTC作用24 h后A549细胞周期的分布 %

图1 5组细胞形态学变化(Hoechst 33342染色,×400)

2.4PDTC对A549细胞AEG-1mRNA和蛋白表达的影响见图2、3，表3。结果显示，PDTC作用后A549细胞AEG-1 mRNA和蛋白表达量均降低，呈明显的剂量依赖关系。

图2 5组细胞AEG-1 mRNA的表达

图3 5组细胞AEG-1蛋白的表达

表3 5组细胞AEG-1 mRNA和蛋白的表达

*:两两比较，P均<0.05。

3 讨论

NF-κB广泛存在于真核细胞内，其作为一种重要的多功能核转录因子，在人体免疫、炎症和肿瘤的发生发展过程中发挥着至关重要的调控作用。研究[5]表明NF-κB具有抗凋亡作用，NF-κB过表达可促进细胞的无限增殖，促使肿瘤的发生发展。体外实验[6]研究发现，阻断NF-κB活性可抑制肿瘤细胞的生长。

PDTC为一种强抗氧化剂，是NF-κB特异性抑制剂，主要通过抑制NF-κB P65亚单位或抑制IκB的降解，减少NF-κB的核移位来抑制NF-κB活性[7]。体外实验[8-10]表明PDTC对多种肿瘤细胞有抑制作用，主要表现在抑制增殖、促进凋亡和对化疗药物增敏等方面。该研究选用PDTC作用于A549细胞，结果显示，PDTC能有效抑制A549细胞增殖并致G0/G1期阻滞，S及G2/M期相应缩短，诱导凋亡,提示PDTC可通过抑制NF-κB活性抑制肺癌细胞的生长，其机制可能与PDTC阻断NF-κB的抗凋亡途径有关。

AEG-1基因位于8q22，全长3 611 kb，包含12个外显子和11个内含子，编码582个氨基酸的蛋白质；最初是从人胚胎星形胶质细胞克隆得到[11-12]。AEG-1作为新发现的基因,其正常的生理功能尚不清楚。近年研究[13-14]发现，AEG-1与一些恶性肿瘤的发生发展及治疗密切相关，AEG-1在大部分正常及良性病变组织中表达水平非常低甚至不表达，而在多数恶性肿瘤组织中呈高表达。 AEG-1作为Ras-PI3K/Akt-GSK3-c-Myc的下游基因，能够调节PI3K/Akt、NF-κB、Wnt/catenin、MAPK、AMPK/mTOR等多条与肿瘤发生发展密切相关的分子信号途径，从而参与正常细胞癌变、肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、转移、肿瘤组织血管生成、肿瘤细胞保护性自噬、化疗耐药等众多环节。该实验证明应用PDTC作用24 h后，随着药物剂量增加，A549细胞内AEG-1 mRNA相对表达量和AEG-1蛋白表达量均逐渐下降。提示PDTC能抑制AEG-1基因的转录和蛋白表达，进而可能影响肿瘤细胞的生长，但其具体机制有待进一步深入研究。

综上所述，PDTC对A549细胞具有显著的体外增殖抑制作用并可改变细胞周期的分布，诱导凋亡，此过程伴随有AEG-1基因的表达下调，提示PDTC可能通过抑制NF-κB活性、下调AEG-1的表达，最终促使肿瘤细胞凋亡。

[1] 马臣,姜永晓,刘曙正,等.河南省居民2010年至2019年肺癌死亡率预测[J].郑州大学学报:医学版,2013,48(2):220

[2] 崔嵩，刘学锋，吴斌.NF-κB在肿瘤中的研究进展[J].现代肿瘤医学，2009，17(1)：134

[3] 秦萌萌，樊青霞.Bortezomib对非小细胞肺癌细胞系增殖、细胞周期及核转录因子活性的影响[J]. 解放军医学杂志,2010,35(5):568

[4] Sarkar D,Emdad L,Lee SG,et al.Astrocyte elevated gene-1:far more than just a gene regulated in astrocytes[J]. Cancer Res,2009,69(22):8529

[5] Xiao CW,Yan X,Li Y,et al.Resistance of human ovarian cancer cells to tumor necrosis factor alpha is a consequence of nuclear factor kappaB-mediated induction of Fas-associated death domain-like interleukin-1beta-converting enzyme-like inhibitory protein[J]. Endocrinology, 2003,144(2):623

[6] Biswas DK,Shi Q,Baily S,et al.NF-kappa B activation in human breast cancer specimens and its role in cell proliferation and apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(27):10137

[7] Kim KS,Oh da H,Choi HM,et al.Pyrrolidine dithiocarbamate, a NF-kappaB inhibitor, upregulates MMP-1 and MMP-13 in IL-1beta-stimulated rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes[J].Eur J Pharmacol,2009,613(1/3):167

[8] 邢丽华,刘剑波,张惠兰,等.抑制NF-κB对人肺癌裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响[J].肿瘤防治研究,2005,32(7):392

[9] 闫亚妮,吴静,张颖,等.抗氧化剂吡咯烷二硫代氨基甲酸有助于提高卡铂对宫颈癌SiHa 细胞化疗的敏感性[J].西安交通大学学报:医学版,2011,32(5):610

[10]Cardoso SM, Oliveira CR. Inhibition of NF-κB renders cells more vulnerable to apoptosis induced by amyloid beta peptides [J]. Free Radic Res, 2003, 37(9): 967

[11]Kang DC,Su ZZ,Sarkar D,et al.Cloning and characterization of HIV-1-inducible astrocyte elevated gene-1,AEG-1[J].Gene,2005,353(1):8

[12]Sarkar D, Park ES, Emdad L, et al. Molecular basis of nuclear factor-kappaB activation by astrocyte elevated gene-1[J].Cancer Res,2008,68(5):1478

[13]Meng F, Luo C, Ma L, et al. Clinical significance of astrocyte elevated gene-1 expression in human epithelial ovarian carcinoma[J].Int J Gynecol Pathol,2011,30(2):145

[14]Emdad L, Sarkar D, Lee SG, et al. Astrocyte elevated gene-1：a novel targate for human glioma therapy[J].Mol Cancer Ther,2010,9(1):79