携带人IL-10基因的腺病毒载体的构建及其对大鼠肝细胞损伤的保护作用*

程 剑，沈晓洁，刘 艳

无锡卫生高等职业技术学校病理学教研室 无锡 214028

白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)是一种抗炎症反应的细胞因子。研究[1]表明，IL-10可以抑制肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、趋化因子和细胞间黏附分子mRNA的表达，从而减轻大鼠的肝损伤。Donckier等[2]发现对猪的肝脏给予IL-10的预治疗，可以降低受体的转氨酶以及减少肝脏的炎性细胞浸润和细胞坏死，减轻肝脏的损伤。另外，T细胞在肝损伤中扮演着重要的角色，IL-10在肝损伤时不仅抑制枯否细胞释放细胞因子，还抑制T细胞功能[3]。因此，IL-10具有保护肝细胞的功能，在肝脏外科和器官移植领域中有很大的应用潜力。作者构建了携带人IL-10(hIL-10)基因的非增殖型重组腺病毒载体，体外细胞学实验验证其对大鼠肝细胞损伤的保护作用，为IL-10基因治疗在肝脏外科和肝脏移植领域中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1携带hIL-10基因的重组腺病毒载体的构建合成hIL-10引物(上游：5’-CCGGAATTCACCATG GCCCACAGCTCAGC-3’，含EcoRⅠ酶切位点；下游：5’-CGACGTCGACTTATCAGTTTCGTATCTTCATTGTC -3’， 含SalⅠ酶切位点，扩增产物大小552 bp)和EGFP引物(上游：5’-GGAAGATCTACCATGGTGAG CAAGGGC-3’, 含BglⅡ酶切位点；下游：5’-TG CACTCGAGTTATTATCTAGATCCGGTGGATC-3’，含XhoⅠ酶切位点，扩增产物大小760 bp)。以pORF-hIL-10质粒(美国Invivo Gen公司产品)为模板，用hIL-10引物PCR扩增hIL-10 cDNA序列。反应参数：96 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s变性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃ 60 s延伸，共20个循环；再72 ℃延伸10 min。扩增产物用80 g/L琼脂糖凝胶电泳, 用胶回收试剂盒回收大小为552 bp的DNA片段。将该片段克隆入pUC19载体中，测序鉴定。将pUC19-hIL-10酶切，回收hIL-10 cDNA片段，克隆入pDC315载体，构建pDC315-hIL-10。同样方法构建对照腺病毒载体pDC315-EGFP。

将质粒pDC315-hIL-10、pDC315-EGFP分别与5型腺病毒骨架质粒pBGHE3通过Lipofectamine2000共转染293细胞，进行细胞内同源重组。2周后各挑取病毒噬斑2个，应用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取腺病毒DNA，经PCR鉴定重组腺病毒DNA中是否克隆了hIL-10、EGFP基因。鉴定正确后，命名为Ad5-hIL-10和Ad5-EGFP。病毒在293细胞中反复扩增，氯化铯梯度离心法纯化。

1.2大鼠肝细胞的分离与培养清洁级的雄性SD大鼠，体质量250～300 g，由上海斯莱克实验动物中心提供。采用二步胶原酶灌注法分离大鼠肝细胞[4]，悬浮于RPMI 1640培养基中，在37 ℃、体积分数5% CO2条件下继续培养。

1.3腺病毒载体感染效率的测定大鼠肝细胞铺96孔板，1×103孔-1，培养24 h，换用无血清培养液，加入感染强度(MOI)=1、5、10、50的Ad5-EGFP，轻摇2 h，吸除上清，换用体积分数2%血清培养液培养48 h后，荧光显微镜下观察，在荧光显微镜暗视野及明视野交替切换，选择3个200倍视野，计数绿色荧光阳性细胞，并计算阳性细胞占总细胞的比例。实验重复3次。

1.4Ad5-hIL-10基因表达的测定大鼠肝细胞铺96孔板，5×104孔-1，培养24 h，换用无血清培养液，加入MOI分别为1、5、10、50的Ad5-hIL-10，轻摇2 h，吸除上清，换用体积分数2%血清培养液，培养48 h。收集培养细胞上清，采用hIL-10 ELISA试剂盒(Invitrogen公司产品)测定hIL-10含量，实验重复3次，方法参考试剂盒说明。

1.5Ad5-hIL-10对CCl4诱导的肝细胞损伤的保护作用大鼠肝细胞铺96孔板，5×104孔-1，培养24 h后，分组处理，每组设8个复孔。A组为实验组：细胞贴壁后，换用无血清培养液，加入MOI分别为1、5、10、50的Ad5-hIL-10，轻摇2 h，吸除上清，换用体积分数2%血清培养液，培养24 h后，加入CCl4(北京化工厂产品)至终浓度0.5 mol/L，继续培养24 h。B组为损伤对照组：细胞感染Ad5-EGFP，与A组同步加入相同浓度的CCl4。C组为空白对照组：细胞同步培养，不加病毒和CCl4。采用MTT法检测细胞存活率。

1.6统计学处理采用SPSS 13.0进行分析。不同MOI预处理大鼠肝细胞中绿色荧光阳性细胞比例、hIL-10含量及3组肝细胞存活率的比较应用单因素方差分析，组间两两比较应用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1重组腺病毒的鉴定病毒噬斑经PCR均扩增出hIL-10或EGFP基因(图1)。

2.2Ad5-EGFP对大鼠肝细胞的感染效率随着MOI的升高，病毒感染效率也逐渐增高，差异有统计学意义(F=25.571,P<0.001)。见表1、图2。

表1 大鼠肝细胞中

*:与MOI=1相比，P<0.01；#：与MOI=5相比，P<0.01；△：与MOI=10相比，P<0.01。

2.3Ad5-hIL-10基因的表达大鼠肝细胞上清中hIL-10含量见表1。随着MOI的升高，hIL-10含量上升，差异有统计学意义(F=52.667，P<0.001)。

图1 重组腺病毒Ad5-hIL-10(上)和Ad5-EGFP(下)的PCR鉴定结果

图2 腺病毒Ad5-EGFP感染大鼠肝细胞的效率(×200)

2.4hIL-10表达对CCl4诱导的大鼠肝细胞损伤的保护作用见表2。

表2 各组大鼠肝细胞存活率的比较

*:与B组比较，P<0.05；#:与C组比较，P<0.05。

3 讨论

肝炎、肝炎后肝硬化以及肝脏外科手术、肝移植都存在肝细胞的损伤，如何减轻肝细胞损伤、保护肝功能成为肝脏病治疗中需要面对的问题。通过基因治疗手段来预防和减轻肝损伤是近年来人们研究的一个新方向。

IL-10是一种多效应的细胞因子，它的主要功能就是限制和终止炎症反应[5]。IL-10由Th2分泌, 能抑制Th1型细胞因子的分泌，对细胞免疫和体液免疫及炎症过程均有广泛影响[6-7]。hIL-10与鼠IL-10蛋白有73%的同源性，hIL-10蛋白可作用于鼠细胞，而鼠IL-10蛋白对人细胞并不起作用。hIL-10 主要由单核细胞、巨噬细胞、T和B淋巴细胞分泌，Th1和Th2受刺激后均可分泌，肝内枯否细胞也可分泌。近年来的研究证实，IL-10是一个多效性细胞因子, 具有广泛的生物学作用：可以抑制T 淋巴细胞，主要参与T淋巴细胞免疫调节，抑制T 淋巴细胞激活，诱导T淋巴细胞免疫耐受，抑制抗体依赖性T 淋巴细胞的增殖[8]；刺激B 淋巴细胞，促进B淋巴细胞激活及其抗体分泌[9]；抑制单核巨噬细胞的激活及其细胞因子的分泌[10]；抑制前炎性细胞因子分泌。总之，IL-10 是一种生物学作用广泛的细胞因子，IL-10 的肝细胞保护作用是一个重要方面。IL-10 可通过抑制前炎性细胞因子的分泌、抑制中性粒细胞的激活与其黏附分子的表达等机制，来抑制肝损伤时的急性期增殖反应和肝纤维化的发生。

作者以腺病毒为载体成功构建了携带hIL-10基因的Ad5-hIL-10，该腺病毒载体可以高效率体外感染大鼠肝细胞并表达其携带的外源基因hIL-10，为外源基因行使生物功能奠定了良好的基础。在此基础上，作者建立CCl4诱导的肝细胞损伤模型，采用Ad5-hIL-10进行预防性干预，发现可以有效预防肝细胞损伤，提高肝细胞在损伤诱导剂存在情况下的存活率。该携带hIL-10基因的腺病毒载体在肝病领域中将有很大的应用潜力。

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