豫医卷毛大鼠表皮生长因子基因的比较生物学分析*

史崇敏，张明昊，朱奎成，杜春燕，王君敏，胡 涛，薛敬礼，章金涛#

1)郑州大学实验动物中心 郑州 450052 2)河南中医学院医学机能实验室 郑州 450046

表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是一种小分子蛋白质，其生物学功能广泛，在生物体生长发育过程中具有重要意义。首先它是一种广谱促分裂剂，能促进细胞内DNA、RNA、蛋白质以及细胞外大分子的合成，并对多种组织来源的上皮细胞有很强的促分裂活性[1-3]；其次，EGF还能防止溃疡发生、促进溃疡愈合及调节精子的发育过程，并具有神经营养活性，参与神经前体细胞的增殖分化及生存、迁移。卷毛突变是一种被毛和胡须均发生弯曲的基因突变。国外[4-9]已报道了几种这样的突变类型，如wave-1、wave-2、cub、swh等。有些卷毛突变还具有一因多效性，伴发皮脂腺、乳腺、心脏和骨骼等发育异常，这些突变模型为研究毛发生长、组织分化、生长调节以及心脏等器官的疾病提供了较有价值的实验材料[10]。豫医卷毛大鼠(Yuyi curly hair rat, YCHR)是2006年1月在SD大鼠种群中新发现的一种自发性突变动物，其卷毛性状受常染色体上单一显性基因控制，呈半显性遗传[11]。作者克隆了YCHR EGF基因的cDNA序列，并与GenBank上发布的其他物种的EGF基因cDNA序列进行了同源性比较，旨在进一步探讨哺乳动物EGF基因的同源性及其比较生物学特征。

1 材料与方法

1.1实验动物8周龄YCHR 10只，雌雄各半，来自郑州大学实验动物中心，一级环境条件下饲养。

1.2EGFcDNA的扩增与测序①DNA的提取及处理：处死大鼠后立即取大鼠脑组织，用液氮速冻，并贮存于-196 ℃液氮罐中，用DNA提取试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司SK1261)提取总DNA，保存于-80 ℃冰箱中待用。②引物设计及合成：参考GenBank上发表的大鼠EGF基因cDNA序列(GenBank登录号：NM012842)，采用DNASTAR软件设计22对重叠引物(表1)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。③扩增与测序：取适量的DNA进行PCR扩增。PCR扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序。

表1 EGF基因cDNA扩增所用引物

续表1

1.3EGFcDNA序列和氨基酸序列分析拼接YCHR EGF cDNA的完整序列，并从GenBank上下载相关物种(BN大鼠、家鼠、原鸡、猕猴和人)EGF cDNA序列，采用DNAMAN软件进行同源性比较与系统遗传学分析。

2 结果

2.1YCHREGFcDNA的克隆PCR产物电泳后，均得到明显特异性的目的条带，产物大小与预期结果一致。将不同引物扩增的测序结果拼接获得YCHR EGF基因的完整cDNA序列(GenBank登录号：JX437943)，该序列全长为3 522 bp，编码由1 061个氨基酸残基组成的蛋白。

2.2EGF基因的比较生物学分析结果见表2、3。系统遗传分析结果见图1。EGF基因的系统进化树显示，YCHR与其他大鼠同在一个进化分支，大鼠与小鼠的亲缘关系也比较近，与鸡、猴、人的亲缘关系较远。

表2 YCHR与其他物种EGF基因编码区核苷酸序列的同源性比较 %

1：大鼠(YCHR)；2：BN大鼠(NM012842)；3：家鼠(J00380)；4：原鸡(AY588969)；5：猕猴(XM001088957)；6：人(X04571)。

表3 YCHR与其他物种EGF氨基酸序列的同源性比较 %

1：大鼠(YCHR)；2：BN大鼠(P07522)；3：家鼠(P01132)；4：原鸡(AAT00452)；5：猕猴(XP001088957)；6：人(P01133)。

图1 EGF基因的系统进化树

3 讨论

EGF基因在哺乳动物生长发育过程中扮演了重要的角色，它的突变可能会导致细胞增殖及机体生长发育的异常[12]。为了深入了解EGF基因组成的差异，作者克隆了YCHR EGF基因共计3 522 bp的cDNA序列，并对包括YCHR在内的5个物种的6条EGF基因的cDNA序列及其编码产物的氨基酸序列的同源性进行了分析。作者发现，YCHR EGF基因同GenBank上发表的BN大鼠、家鼠、原鸡、猕猴、人的同源性分别为97.8%、83.4%、59.7%、76.5%、73.5%，氨基酸序列的同源性分别为99.3%、79.9%、52.9%、69.6%、69.4%，表明该基因在进化过程中具有一定的保守性，但不同物种之间也存在特异性。就EGF基因及其编码蛋白而言，人类与模式生物之间存在一定的序列与功能异同，因此可以利用这一特点，把其他物种来源的EGF基因作为人类EGF基因天然存在的“突变体”，进一步研究该基因的结构与功能特性。

综上所述，该研究得到了YCHR EGF基因的cDNA序列，已经提交给GenBank，并通过不同物种EGF基因序列的同源性比较，初步了解了EGF基因在物种进化上的保守性与特异性，为下一步进行多态性检测及其与YCHR某些性状的相关性研究奠定了基础。

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