小RNA技术干扰p21联合环磷酰胺对HepG2细胞增殖及凋亡的影响

刘红云，包永芬，单士刚

(1湖北科技学院基础医学院医学免疫学教研室，咸宁 437100;2湖北科技学院基础医学院医学微生物学教研室;3湖北科技学院基础医学院医学细胞生物学与遗传学教研室;*通讯作者，E-mail:ssgang121@163.com)

P21蛋白是调控细胞周期的抑制蛋白，在调节细胞增殖中起非常重要的作用，其基因缺失、失活与多种肿瘤的发生、发展及预后有关［1］。近年来，在癌症治疗当中使用的很多新型抗癌药物、放射疗法、基因疗法等都与p21有着密切的联系，比如:在验证p21基因高表达的人胃癌细胞系对化疗药物的敏感性实验中，p21基因可提高靶细胞对5-FU的敏感性［2］。癌症的发生、发展是癌基因的激活和/或抑癌基因失活的结果，是多因素、多基因参与引起的，抑癌基因在此起到负性调控的作用。而且，p21基因表达与否与肝细胞癌发生、发展的相关性尚需完善。鉴于此，本研究通过小RNA干扰技术抑制肝癌细胞系HepG2中p21基因的表达，同时联合化疗药物环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)观察其联合作用对HepG2细胞增殖及细胞凋亡效应的影响，为临床应用提供理论线索。

1 材料与方法

1.1 细胞株和试剂

人肝癌细胞系HepG2购买于武汉大学中国典型培养物保藏中心。胎牛血清、DMEM培养基为美国Gibco公司产品。CTX和四甲基氮唑蓝(methythiazoletrazolium，MTT)购自美国 Sigma公司。p21基因siRNA序列由上海生物工程有限公司设计并合成。细胞裂解液、caspase-3、caspase-9和caspase-6活性检测试剂盒均购自美国R＆D公司。细胞凋亡检测试剂盒为杭州联科生物技术有限公司产品。脂质体转染试剂购自上海吉玛制药技术有限公司。小鼠抗人β－actin一抗、小鼠抗人p21一抗和羊抗鼠二抗均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，经0.25%胰蛋白酶消化传代后在含5%CO2的37℃培养箱内培养，每2 d传代一次。

1.2.2 小RNA对p21的抑制作用 采用Western blot方法检测P21蛋白表达情况。选处于对数生长期的HepG2细胞制备成单细胞悬液(3.0×105/ml)接种在24孔培养板中，每孔1 ml细胞悬液，待细胞贴壁后，参照转染试剂说明书进行RNA干扰实验，设3个实验组:空白对照组(不加小RNA序列);小RNA处理组(加小RNA序列);阴性对照组(加阴性对照小RNA)。转染36 h后收集HepG2细胞。在上述三组细胞中加入150μl细胞裂解液裂解细胞后，按照试剂盒要求提取总蛋白，制作聚丙烯酰胺浓缩胶和分离胶，取不同组别的等量蛋白样品进行电泳，然后依次转膜、封闭、一抗二抗孵育和洗涤(其中一抗稀释浓度为1∶400;二抗稀释浓度为1∶5 000)后，ECL显色曝光并通过X线胶片曝光洗片，经自动电泳凝胶分析系统扫描并测定各组蛋白条带的相对表达量。

1.2.3 MTT试验 选处于对数生长期的HepG2细胞制备单细胞悬液，以每孔3.0×103个细胞接种于96孔培养板。CTX浓度参考本课题组预实验结果，选用10μg/L。细胞随机分成5组:①空白对照组;②阴性对照组(阴性小RNA序列);③干扰组(加p21小RNA序列);④CTX组(2 mg/L CTX处理);⑤联合组(p21小RNA序列+10μg/L CTX处理)，每孔细胞设8个复孔。按文献［2］所述实验步骤，在处理24 h后，测定540 nm处的吸光度OD值，计算细胞增殖百分率［实验组OD值/对照组OD值×100%］。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡情况 HepG2细胞按1.2.3所述方法处理24 h后，常规洗涤消化，离心收集细胞制备成浓度为5.0×106/ml单细胞悬液，取 100μl细胞悬液，加入 400μl 1×Binding Buffer重悬细胞，分别加入5μl AnnexinⅤ-FITC和10μl PI混匀，室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞凋亡变化情况。

1.2.5 采用Elisa方法测定HepG2细胞caspase-3、caspase-9和caspase-6活性 HepG2细胞按1.2.3所述方法处理24 h后，按照1.2.2所述方法提取总蛋白，caspase-3、caspase-9和caspase-6活性具体检测方法参照试剂盒说明书的描述进行。测定实验体系在405 nm处的吸光度OD值，确定各组细胞中caspase-3、caspase-9和caspase-6的活化水平。

1.3 统计学分析

所获数据均采用SPSS13.0版软件包进行统计学处理，实验数据以±s表示，组间均数比较用方差分析和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p21靶向小RNA序列对HepG2细胞p21的沉默效率

Western blot结果表明，小RNA干扰组P21蛋白表达水平显著低于空白对照组和阴性对照组(P＜0.01);而阴性对照组与空白对照组P21蛋白表达水平比较则差异无统计学意义(P＞0.05，见图1)。

图1 Western blot检测HepG2细胞中P21蛋白表达Figure 1 Expression of P21 protein in HepG2 cells by Western blot

2.2 细胞增殖率检测结果

相对于空白对照组和阴性对照组，干扰组、CTX组和联合组细胞增殖率显著降低(P＜0.01);同时，联合组细胞增殖率相对于CTX组亦明显降低(P＜0.01，见图2)。

2.3 细胞凋亡分析结果

相对于空白对照组和阴性对照组，干扰组、CTX组和联合组凋亡细胞百分率显著升高(P＜0.01);同时，联合组凋亡细胞百分率相对于CTX组亦显著升高(P＜0.01，见图3)。

图2 经不同处理后HepG2细胞增殖率变化(±s).Figure 2 Changes of HepG2 cell proliferation after different treatments(±s)

图3 经不同处理方式后HepG2细胞凋亡百分比变化(±s)Figure 3 Changes of HepG2 cell apoptosis after different treatments(±s)

2.4 caspase-3、caspase-9 和caspase-6 活化程度变化

相对于空白对照组和阴性对照组，干扰组、CTX组和联合组细胞中caspase-3、caspase-9和caspase-6活化程度均有显著升高(P＜0.01);同时，联合组细胞中caspase-3、caspase-9和caspase-6活化程度亦明显高于CTX组(P＜0.01，见表1)。

3 讨论

表1 不同处理方式对HepG2中caspase-3、caspase-9和caspase-6活性的影响(±s，n=3)Table 1 Changes of activities of caspase-3，caspase-6 and caspase-9 in Hep G2 cells after different treatments(±s，n=3)

表1 不同处理方式对HepG2中caspase-3、caspase-9和caspase-6活性的影响(±s，n=3)Table 1 Changes of activities of caspase-3，caspase-6 and caspase-9 in Hep G2 cells after different treatments(±s，n=3)

与空白对照组和阴性对照组比较，*P＜0.01;与 CTX组比较，#P＜0.01

干扰组CTX 组 8.560 9±0.45* 6.923 1±0.30* 5.265 1±0.15*联合组 10.281 9±0.23*#7.624 1±0.14*#6.016 2±0.25*#

DNA损伤引发的细胞凋亡是目前临床应用DNA烷化剂类化疗药物发挥抗癌作用的普遍分子机制［3］。当DNA损伤可激活抑癌基因p53，活化的p53可以在转录水平启动p21的表达，作为细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p21可以通过抑制细胞周期中DNA的合成过程，使细胞周期阻滞在S期，进而使受损细胞有充分的时间完成DNA修复，如修复不完全，细胞则通过启动程序性细胞死亡即凋亡来防止受损DNA 传递到下一代［4，5］。因此，我们设想通过小RNA干扰技术抑制p21基因，使细胞周期调节通路p53-p21受阻，导致受损细胞无法及时完成DNA修复进而增强其对化疗药物的敏感性。

本实验以肝癌细胞HepG2为研究对象，观察p21沉默联合CTX处理对HepG2细胞的生物学作用，检验p21沉默在肝癌治疗中的作用及可行性。细胞增殖率和流式细胞术结果显示，相对于空白对照组和阴性对照组，干扰组、CTX组和联合组细胞凋亡率显著上升，同时，联合组细胞凋亡率亦明显高于CTX组，提示在本研究中，p21沉默和CTX处理两者联合应用有明显的协同作用。caspase家族成员是启动和执行哺乳动物细胞凋亡关键蛋白因子，细胞凋亡发生时，caspase-9为凋亡始动因子，可以在其他凋亡因子参与下发生自我活化并激活下游凋亡执行因子caspase-3和caspase-6，后者则作用于特异性底物使细胞发生生化及形态学改变，导致细胞凋亡［6］。本研究表明，相对于 CTX组，p21小 RNA序列联合 CTX处理可明显增强 HepG2细胞中caspase-9、caspase-3和caspase-6的活化程度，又由于caspase-9是线粒体依赖性细胞凋亡的关键细胞因子［6］，提示线粒体在p21沉默对细胞凋亡的促进作用中发挥了关键作用。

综上所述，本研究通过针对p21基因的小RNA序列有效地抑制了HepG2细胞中p21基因的表达，阻碍DNA损伤修复过程，而达到促进HepG2细胞凋亡的作用。因此，p21基因沉默结合传统化疗可能在肝癌的治疗中具有潜在的应用价值。

［1］Hill R，Bodzak E，Blough MD，etal.p53 binding to the p21 promoter is dependent on the nature of DNA damage［J］.Cell Cycle，2008，7(15):2535－2543.

［2］曹岩，郑永晨，黄颖.p21基因转染人胃癌细胞对化疗药物敏感性的影响［J］.吉林大学学报:医学版，2005，31(5):785－787.

［3］郑长青，季守平，章扬培.DNA损伤修复与肿瘤烷化剂化疗［J］.军事医学科学院院刊，2009，33(1):77－80.

［4］Zhang H，Hannon GJ，Beach D.p21-containing cyclin kinases exist in both active and inactive states［J］.Genes Dev，1994，8(15):1750－1758.

［5］Cazzalini O，Perucca P，Riva F，etal.p21CDKN1A does not interfere with loading of PCNA at DNA replication sites，but inhibits subsequent binding of DNA polymerase delta at the G1/S phase transition［J］.Cell Cycle，2003，2(6):596－603.

［6］赵瑞杰，李引乾，王会，等.Caspase家族与细胞凋亡的关系［J］.中国畜牧杂志，2010，46(17):73－78.