血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa基因多态性与血小板输注疗效的关系

顾 萍，王 静，张 帆，姚如恩，傅启华

(上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科，上海200127)

血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa，又称整合素αⅡbβ3，是血小板(PLT)膜上含量最多的膜糖蛋白，通常以复合物形式分布于PLT和巨核细胞表面，是PLT膜的主要受体。GPⅡb/Ⅲa基因的多态性构成不同的PLT血型，是造成PLT输注无效的免疫性因素。

材料和方法

一、对象

98例单采PLT输注患者均来自上海儿童医学中心血液肿瘤科，2010年8月至2011年10月的血液病治疗期间共输注单采PLT 1 468袋，均为输注单采PLT 3次以上且历时半年以上。其中男59例，女39例，年龄5个月～16岁。患者来源为全国各地，江苏、浙江、上海地区占大多数。对照组30例，均为非血液病患者，因PLT减少或术中输注单采PLT 2次以下。

二、方法

1.标本采集 采集患者静脉血标本，以0.109 mol/L柠檬酸钠1∶9抗凝。标本为分2份，1份用于PLT抗体检测，分离血浆于－20℃冻存，1周内检测完毕;另 1份用于抽提 DNA，－80℃冻存。

2.单采PLT来源 单采PLT由上海市血液中心提供。使用Haemonetics MCS+全自动血液成份分离机采集健康献血者PLT。每单位PLT容量约250 mL，含 PLT 约2.5×1011个。

3.试剂与仪器 TIANamp Blood DNA Kit试剂盒由北京天根生化科技有限公司生产。引物设计参照 NCBI GenBank中 GPⅡb/Ⅲa基因(ITGA2B和ITGB)序列(序列号 NG008331)，由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列见表1。聚合酶链反应(PCR)扩增试剂由TaKaRa公司(大连宝生物)生产。PLT抗体检测试剂盒(固相凝集法)及专用离心机由长春博德生物技术有限责任公司生产。PLT计数采用SYSMEX XS-800i全自动血液分析仪，配套试剂、校准品及质控品等均由Sysmex公司生产。

表1 GPⅡb/Ⅲa上的PLT抗原扩增引物序列

4.GPⅡb/Ⅲa基因多态性检测 按试剂盒说明书要求，提取患者基因组DNA进行PCR扩增反应。反应总体积 25μL，包括患者 DNA 1 μL、Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.25 μL、10× 缓冲液2.5 μL、dNTP(10 mmol/L)2 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、H2O 17.25 μL。扩增条件:95℃ 5 min，然后95℃变性30 s，56～62℃退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，30个循环后，72 ℃10 min。PCR产物经虾碱酶(上海申能博彩生物科技有限公司产品)纯化后直接测序，所用仪器型号为ABI 3730 DNA测序仪。

5.PLT特异性及相关性抗体检测 按试剂盒说明书采用固相凝集法检测患者血浆中IgG型PLT抗体。

6.PLT输注指征 患者PLT减少，有颅内出血、体表有出血点、紫癜、鼻衄、龈血、血尿、消化道出血等出血症状或/和PLT计数＜20×109/L伴或不伴出血症状。

7.PLT输注疗效评价 本研究采用输注后24h PLT计数纠正增加指数(corrected count increment，CCI)作为评判依据。CCI=绝对增加数×体表面积/输入PLT总数。输注后24h CCI＞4.5为输注有效，否则为输注无效。

三、统计学方法

采用SPSS 13.0软件统计。采用卡方检验进行数据分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、GPⅡb/Ⅲa基因多态性检测结果

对所有患者的GPⅡb的E26和GPⅢa的E3、E4、E10、E12 外显子进行测序分析，并与Genbank(序列号NG008331)相比对，结果除GPⅡb的E26存在T18809G的变异外，其他外显子未发现变异。T18809G变异导致Ⅱb基因编码843位的异亮氨酸为丝氨酸所取代，产生I843S(Ile843Ser)多态性。此多态性形成了PLT特异性抗原(human platelet antigen，HPA)-3血型的3种基因型，即 HPA-3aa、HPA-3ab、HPA-3bb(图1)。3种基因型的例数分别为31、46、21例。

图1 HPA-3基因多态性产生的3种血小板血型

二、PLT特异性及相关性抗体检测结果

PLT抗体包括由PLT HPA产生的PLT特异性抗体和由HLA、红细胞抗原等共同抗原产生的相关性抗体。患者组PLT抗体阳性率为52.0%，明显高于对照组(13.3%，P＜0.01)，见表2。说明PLT抗体在多次输注PLT的血液科患者中明显升高。3种HPA-3基因型之间PLT抗体阳性率无差异(P＞0.05)，说明HPA-3 3种基因型患者在多次输注PLT后都会产生PLT抗体，相互间无区别。见表3。

表2 PLT抗体检测结果

表3 3种HPA基因型产生PLT抗体的比较

三、PLT输注效果评价

1 468袋PLT中有1 142袋输注后24h CCI＞4.5，有效率为77.8%。PLT输注的有效性在HPA-3的3个基因型中无明显差异(P＞0.05)，其中HPA-3ab略高，见表4。对51例存在PLT抗体的患者中的21例做了PLT配合性输注，共输注单采 PLT 65袋，有效输注54次，有效率为83.1%。

表4 PLT输注疗效在HPA-3基因型中的比较

讨 论

PLT GPⅡb/Ⅲa复合物是由α和β以非共价键结合而组成的异二聚体蛋白，其编码基因ITGA2B和ITGB3均位于染色体17q21～22上，以常染色体双等位基因以共显性模式控制。GPⅡb基因(ITGA2B)长17.2 Kb，含30个外显子，编码1 039个氨基酸。GPⅢa基因(ITGB3)长度为46 Kb，属于单拷贝基因，含15个外显子，编码778个氨基酸。GPⅡb和GPⅢa上均有很高的多态性，除HPA-14w外，绝大多数是由相应PLT GP结构基因中的单核苷酸多态性(SNP)引起，其多态性构成了人类PLT HPA，并表现为PLT独特的遗传多态性。

GPⅡb的第26外显子上存在I843S和V837M 2个多态性，分别构成HPA-3和HPA-9血型。GPⅢa的第3、4、10、12外显子上存在L33P、R143Q、R489Q、P407A、R636C、R62Q、R663H 多态性，构成 HPA-1、HPA-4、HPA-6、HPA-7、HPA-8、HPA-10和HPA-11共7个血型。

本研究通过对98例长期输注PLT的血液病患者GPⅡb和GPⅢa的9个多态性位点的检测，发现GPⅡb上存在I 843S多态性，即HPA-3aa、HPA-3ab和HPA-3bb 3个基因型，其余多态性未检出。迄今为止，已有多篇文献［1-7］报道了不同国家、不同地区、不同人群的HPA基因检测频率存在差异。我国汉族人群的HPA多态性大多集中在HPA-1～6和 HPA-15上，特别是 HPA-3和HPA-15，该二者的a、b等位基因频率几乎各占一半，其a/b抗原不配合几率越高，在PLT输注时刺激受者免疫系统产生PLT抗体的几率就越大，HPA-3尤为严重。本研究结果显示，98例患者HPA-3的基因频率趋势与报道类似，因是收治的血液病患者而非普通人群调查，所以只能显示大体趋势。本研究未检出多态性的HPA-4、7、8、9、10、11的aa型频率在江苏、浙江、上海地区汉族人群中均为100%［6］，HPA-1、6的 aa型频率均＞98%。本研究的标本量相对较小，是未能检出多态性的原因。

GPⅡb/Ⅲa基因多态性导致分子结构的空间构象发生改变，改变了其抗原性，调节了其表达水平，表面抗原构象的改变导致抗体的产生，进而影响PLT输注的疗效，出现输注耐受现象。PLT抗体包括特异性抗体和相关性抗体，分别由HPA、共同抗原(包括 HLA和ABO、Lewis、P等红细胞血型抗原)免疫刺激而产生。本研究结果显示，98例患者长期输注PLT后，有52%的患者产生PLT抗体，有效输注率为77.8%。产生PLT抗体的患者并非每次输注随机的PLT都无效，本研究结果显示，HPA-3ab型患者输注有效率最高(78.9%)，aa 型 居 中 (77.2%)，bb 型 最 低(76.3%)。这种情况可能与献血员的PLT血型有关。如aa型患者数量多于bb型，根据基因频率，此型献血员数量也应该多于bb型，而ab型患者可接受aa、bb和ab 3种基因型的PLT，这些因素可能是造成aa型和ab型患者PLT输注有效率略高的原因。此外，PLT相关抗体中的HLA抗体对PLT输注效果影响很大，故HPA-3ab型患者并非每次输注都有效，而且21例有抗体的患者输注65袋配合型的PLT后，疗效仅为83.1%。HPA抗体最易产生，但由于HLA更具多态性，因此HLA抗体更常见。机体产生的HLA抗体往往具有多特异性。当HLA抗体合并HPA抗体时，PLT输注无效更易发生。HLA抗体数量占主要地位，其次为HPA抗体［8-9］。故PLT抗体是造成输注无效的免疫性原因，PLT GP多态性是产生PLT抗体的主要原因之一。

全世界每年用于治疗性输注的PLT有几百万单位，但随之而来的是由此而引发的同种免疫应答等造成的输注无效［10］。治疗PLT输注无效，应当从病因着手，采取不同的治疗方案。由非免疫因素引起的输注无效，应以治疗原发病为主，如抗感染、脾切除、增加PLT输注量来提高效果，而由免疫因素引起的，则应首先选择PLT相容性输注［11］，即选择 ABO同型、HLA和 HPA交叉配型均相合的单采PLT输注［12］，给患者输注“合适的PLT”，取代随机性 PLT的输注［13］。但在实际工作中寻找三者完全相同的PLT非常困难，只有部分患者可在其亲属中找到，因此除依靠采血机构建立HLA和HPA供者分型库提供及时、有效的输注途径外，临床上使用去除白细胞的PLT、γ-辐照PLT、药物(丙种球蛋白)等也是必不可少的治疗方案。

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