HbA1c和HbA0的分离纯化

涂国华， 王碧筠， 朱云娇， 秦 瑛， 姜旭淦

(1.无锡市滨湖区中医院检验科，江苏无锡214121;2.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212013)

正常人主要血红蛋白A包括与糖结合部分的HbA1和未结合糖部分的HbA0，其中HbA1包括HbA1a1、HbA1a2、HbA1b、HbA1c［1］。 HbA1c约 占HbA1的80%。国际临床化学联合会(IFCC)把HbA1c定义为Hb 1条或2条β链氨基末端与葡萄糖形成的稳定、不可逆的四聚体加成化合物(N-1-脱氧果糖基-Hb)［2］。其糖基化反应分2步:首先葡萄糖羰基与Hb的β链氨基末端缬氨酸的自由氨基缩合，生成不稳定醛亚胺即希夫式碱(Schiff base，前HbA1c)，此反应可逆;第2步醛亚胺经不可逆的Amadori重排形成稳定的酮胺［3］。

2010年美国糖尿病协会(ADA)首次将HbA1c≥6.5% 作为糖尿病诊断标准，HbA1c在5.7%～6.4%范围内可认为是糖尿病高风险人群，并要求实验室应采用经美国糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)认可并符合糖尿病控制与并发症试验(DCCT)检测标准的方法进行检测［4］。HbA1c反映了过去2～3个月血糖平均控制水平［5］。

糖化血红蛋白的免疫法测定是目前临床常用方法之一，其原理是采用能识别糖化血红蛋白β-链氨基末端几个糖基化氨基酸的特异性抗体与HbA1c反应，形成抗原抗体复合物来进行检测。该类方法快速、简便，可在自动化仪器上检测［6］。

在制备糖化血红蛋白抗体和建立糖化血红蛋白的免疫学测定方法时，需要获得高纯度的HbA1c和 HbA0组分。同时分离纯化的 HbA1c和HbA0可用于制备糖化血红蛋白检测的校准品、标准品以及质控品。国内糖化血红蛋白检测均为各级实验室自己建立的方法和参考区间，还未实行检测的标准化。国际标准品制备方法［7］报道采用琼脂糖亲和层析分离糖化血红蛋白及瑞典Mono S强酸阳离子交换树脂纯化。目前国内还缺乏HbA1c和HbA0分离和纯化方面的报道。因Bio-Rex 70弱酸阳离子交换树脂可商业获得，我们参考该法，采用弱酸阳离子交换层析法和硼酸琼脂糖亲和层析法对健康人全血溶血液中的HbA1c和HbA0进行了分离和纯化。

材料和方法

一、材料

高效液相色谱(HPLC)仪为Waters公司生产，检测器为Waters 2487型，双泵为515 pump;UV-2550紫外可见分光光度计(日本岛津);eppendorf-5417R高速离心机;垂直电泳仪(Rio-Rad公司);Biowave DNA型蛋白核酸分析仪(英国Biochrom公司);层析柱(16 mm×300 mm，10 mm×300 mm)购自江阴新辉层析设备有限公司;透析袋(MW:8000-14000)购自美国联合碳化物公司。Bio-Rex 70弱酸阳离子交换树脂(200～400目，Na+型)、硼酸琼脂糖亲和层析树脂、氰化高铁血红蛋白(HiCN)比色法试剂、聚乙二醇20000。

二、方法

1.临床标本采集及溶血液的制备 收集镇江市第一人民医院经体检各项指标正常的健康人全血，所有标本采用EDTA-K2抗凝。红细胞溶血液按IFCC参考方法［8］中制备的要求进行。

2.弱酸阳离子交换层析法分离 HbA1c和HbA0的实验条件 手工分离柱离子交换试剂A液为40 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH值6.6)，B液为100 mmol/L NaCl(pH值6.4，含20 mmol/L PBS)，C 液为400 mmol/L NaCl。Bio-Rex 70树脂的活化与装柱过程参照文献［9］。活化后的树脂采用A液保存。将Bio-Rex 70弱酸阳离子交换树脂搅拌均匀，装入层析柱(16 mm×300 mm)中，填料上端覆盖少量A液备用。新手工装制备层析柱分离时温度控制在22～25℃，选择415 nm波长监测层析柱分离洗脱吸光度(A)值。A液洗脱HbA1a+HbA1b部分，B洗脱 HbA1c部分，收集 A值峰值部分;再加C液洗脱HbA0部分，收集A值峰值部分。收集的2个峰值部分分别装入预处理的透析袋，聚乙二醇20000浓缩，并用蒸馏水4℃透析24h。采用HPLC-Bio-Rex 70鉴定纯度［10］。

3.硼酸琼脂糖亲和层析法纯化 HbA1c和HbA0的实验条件 亲和洗涤缓冲液(pH值8.0):0.25 mol/L 乙酸铵、50 mmol/L MgCl2、0.2 g/L NaN3;亲和洗脱缓冲液(pH值8.5):0.2 mol/L山梨醇、0.1 mol/L Tris、0.2 g/L NaN3。取约 20 mL硼酸琼脂糖亲和层析树脂，装入层析柱(10 mm×300 mm)，防止产生气泡，洗涤缓冲液平衡柱pH值至8.0即可使用。使用过的层析柱可用HCl再生后重复使用。按照每毫升亲和层析树脂加0.3 mg HbA1c或者 1.5 mg HbA0粗分离样品。

4.HbA1c的纯化 弱酸阳离子交换层析法分离HbA1c，应用硼酸琼脂糖亲和层析法纯化，415 nm波长监测洗涤液A值，待A值不再下降后加洗脱缓冲液，收集A值峰值部分，4℃浓缩并透析24h。采用 HPLC-Bio-Rex 70 鉴定纯度［9］并做十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳［11］。

5.HbA0纯化 采用弱酸阳离子交换层析法分离HbA0，用亲和洗涤缓冲液洗脱，415 nm波长监测亲和洗涤液A值，收集A值峰值部分。4℃浓缩并透析。采用HPLC-Bio-Rex 70鉴定纯度［10］并做 SDS-PAGE 电泳［11］。

结 果

一、将弱酸阳离子交换层析法获得的HbA1c和HbA0组分用HPLC法检测纯度分别为79.78%和97.42%。见图1。

二、用HPLC分别检测经硼酸琼酯糖亲和层析法纯化后的 HbA1c和 HbA0，其纯度分别为94.53%和 99.73%。见图2。

三、SDS-PAGE电泳显示采用硼酸琼脂糖亲和层析法纯化后的HbA1c和HbA0均为单一条带。HbA1c和HbA0均为四聚体的四级结构，经变性后变成三级结构的亚基。电泳条带位置位于相对分子质量14 000～25 000。见图3。

图1 HPLC对弱酸阳离子交换层析法HbA1c和HbA0的检测结果

图2 HPLC对硼酸琼脂糖亲和层析法纯化后的HbA1c和HbA0检测结果

图3 经硼酸琼脂糖亲和层析法纯化后HbA1c和HbA0的SDS-PAGE电泳结果

讨 论

分离纯化的糖化血红蛋白可用于标准品的制备，HbA1c与HbA0还可按比率混合制备质控品、校准品，有利于各实验室结果的比较及质量控制。同时，分离纯化的糖化血红蛋白可作为免疫抗原来制备单克隆、多克隆抗体，也可作为酶联免疫吸附试验(ELISA)的包被抗原，来检测抗体效价。纯化的HbA0可用于筛选检测糖化血红蛋白的单克隆抗体是否有交叉反应，因为糖化血红蛋白单克隆抗体应只识别HbA1c而不与HbA0反应。

弱酸阳离子交换层析法基于Hb各组分等电点不同，在弱酸性条件下所带电荷数量存在差异，与离子交换树脂的吸附和交换能力不同而分离。带电荷较少的糖化血红蛋白部分先洗脱，而电荷较多的非糖化血红蛋白后洗脱。使用低离子强度的缓冲液即可洗脱HbA1，高离子强度的缓冲液即可洗脱非糖化血红蛋白［12］。Bio-Rex 70阳离子交换树脂使用不同离子强度和pH值的磷酸盐缓冲液来洗脱可以分离的糖化血红蛋白及其组分，为DCCT和NGSP参考方法所采用［13］。本研究中以Bio-Rex 70弱酸阳离子交换树脂为填料，装备了用于糖化血红蛋白分离的制备柱，获得了HbA1c和HbA0组分，用HPLC检测HbA1c和HbA0的纯度分别为79.78%和97.42%。本研究结果说明分离的HbA1c中含有少量HbA0，而分离的HbA0中含有少量 HbA1c。Goodall等［14］报道，Bio-Rex 70 弱酸阳离子交换树脂分离的HbA1c峰值部分经亲和树脂层析仅仅65%～75%是糖基化部分，本研究结果与之相符。Bio-Rex 70弱酸阳离子交换树脂检测HbA1c纯度最高能够达到多少，有待于进一步采用IFCC参考方法［7］检测并比较验证。因IFCC参考方法条件的限制，并未采用此法测定纯度。

硼酸琼脂糖亲和层析法是利用硼酸基团可与糖化血红蛋白分子上葡萄糖的1，2－顺位二元醇可逆结合而进行分离。这种顺位二元醇结合是非特异的，所有顺位二元醇结构的分子均可结合到氨基苯硼酸集团上。Goodall等［14］报道，与亲和层析树脂结合的糖基化部分通过比色法分析显示含有10%的 HbA1a+HbA1b，52%的 HbA1c和38%的HbA0;亲和层析非糖化部分经比色分析显示主要为HbA1a+HbA1b和 HbA0，同时含有少量HbA1c。由此可见，硼酸琼脂糖亲和层析法用于HbA1c和HbA0分离的第1步，其效果将不如弱酸阳离子交换层析法。因此，本研究将其用于对HbA1c和HbA0粗制品的纯化。研究结果表明，弱酸阳离子交换层析法分离的HbA1c和HbA0经硼酸琼脂糖亲和层析法纯化后的纯度分别为94.53%和99.73%。本研究结果提示单独采用离子交换树脂方法或者亲和层析方法分离血红蛋白组分效果并不理想，必须2种方法结合，才能获得较好的分离效果。

致谢:本实验得到了江苏大学基础医学与医学技术学院姜旭淦老师的大力支持与帮助，在此表示衷心的感谢。

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