急性心肌梗死大鼠心肌组织SDF-1/CXCR4表达的变化

许官学 盛 瑾 石 蓓 (贵州省遵义医学院附属医院心血管内科，贵州 遵义 563003)

CXC族细胞因子受体4(CXCR4)是目前所知的基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的唯一受体。近年来，SDF-1/CXCR4在缺血性心脏病治疗中的作用机制成为新的研究热点。然而，在心肌梗死前后，SDF-1/CXCR4在心脏不同部位心肌组织的表达变化鲜有文献报道。本研究通过测定急性心肌梗死大鼠心肌SDF-1与CXCR4的表达水平，探讨SDF-1和CXCR4与心肌梗死后心脏功能变化的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6～8周龄雄性SD大鼠，体重200～250 g，重庆医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 试剂 L-DMEM培养液、胰蛋白酶、胎牛血清，Hyclone;Perfect Real Time PCR Kit、SDF-1、CXCR4 上下游引物，TaKaRa;CXCR4(兔IgG)，Abcam;FITC牛抗羊SDF-1抗体、SDF-1(山羊IgG)、驴抗兔 CXCR4 抗体，Santa Cruz Biotechnology。

1.1.3 实验仪器 激光共聚焦显微镜，Leica SP2公司;PTPCR分析仪，Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 SD大鼠64只，随机分为试验组及假手术对照组，每组32只。试验组结扎冠状动脉左前降支制作急性心肌梗死模型;对照组仅开胸，不结扎冠状动脉。分别于术后1、7、14、28 d，每组处死8只取心脏作相关检测。若心梗术中及取材前大鼠死亡，弃去此大鼠，保证每时间点均为8只。

1.2.2 大鼠心肌梗死模型的建立 SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3～0.35 ml/100 g)麻醉。胸骨左缘第3、4肋间打开胸腔，结扎左冠状动脉前降支，分层缝合关闭胸腔。术后连续3 d腹腔注射青霉素40万单位防治感染〔1〕。对照组仅开胸，不结扎冠状动脉。

1.2.3 动物取材 大鼠常规颈椎脱臼处死，开胸后分离心脏与胸前壁之间粘连组织，由大血管根部切取下心脏。

1.2.4 心功能的测定 术后第28天，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后经胸壁行超声心动图检查。检测指标包括:左心室收缩末期内径(LVDs)、左心室舒张末期内径(LVDd)、左室射血分数(EF)。所有指标均取5个连续心动周期测量的平均值。

1.2.5 Real Time(RT)-PCR检测心肌 SDF-1、CXCR4 mRNA心肌组织无菌生理盐水冲洗，去除心脏内残余血液后作RTPCR检测，测定术前、术后各时间点心肌SDF-1、CXCR4 mRNA的含量。Actb(150 bp)上游引物 5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游引物 5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'。SDF-1(134 bp)上游引物 5'-TGAGAGCCATGTCGCCAGA-3'，下游引物 5'-GGATCCACTTTAATTTCGGGTCAA-3'。CXCR4(149 bp)上游引物 5'-AGCAGGTAGCAGTGACCCTCTGA-3'，下游引物5'-GAAGCAGGGTTCCTTGTTGGAGT-3'。

1.2.6 激光共聚焦检测 部分心肌组织冰冻切片后作免疫激光共聚焦检测。共聚焦系统由Bio-Rad公司提供的软件控制，在IBM计算机上运行。每组随机选取30个点，扫描细胞及心肌图像，分析软件分析SDF-1/CXCR4在细胞膜及心肌组织中荧光强度。

1.3 统计学分析 应用SPSS16.0统计软件处理数据，计量资料以s表示，组间比较用单因素方差分析。

2 结果

2.1 心肌梗死模型建立 大鼠左冠状动脉结扎术后心电图肢导R波振幅显著升高，胸导联ST段弓背向上抬高＞0.1 mV，并持续0.5 h以上。4 h后检查心电图，出现病理性Q波，呈典型的心肌梗死动态改变图像，提示为心肌梗死，证实模型成功。

2.2 两组超声心动图检测心功能比较 心肌梗死后28 d，超声心动图检测心脏功能结果见表1，组间比较有显著性差异(P ＜0.05)。

2.3 两组心肌SDF-1、CXCR4 mRNA表达比较 两组心肌组织均有SDF-1、CXCR4 mRNA表达。试验组SDF-1、CXCR4 mRNA表达明显增加，组间比较有显著性差异(P＜0.05)。见表2，表 3。

表1 心肌梗死后28 d两组心功能指标的比较( s，n=8)

表1 心肌梗死后28 d两组心功能指标的比较( s，n=8)

与对照组比较:1)P＜0.05;下表同

组别 LVDd(mm)LVDs(mm)EF(%)试验组 28.14±0.391) 20.17±0.531) 33.32±6.881)对照组20.97±0.41 13.01±0.40 51.79±5.11

表2 各组不同时期SDF-1 mRNA的表达( s，n=8)

表2 各组不同时期SDF-1 mRNA的表达( s，n=8)

1 d 7 d 14 d 28 d试验组44.85±6.251)42.48±11.281)36.38±8.221)33.59±4.611)组别对照组 14.17±2.42 13.80±1.92 13.48±1.56 13.14±1.37

表3 各组不同时期CXCR4 mRNA的表达( s，n=8)

1 d 7 d 14 d 28 d试验组25.69±2.781)22.07±1.641)17.73±3.781)17.47±2.921)组别对照组8.03±1.97 7.95±1.84 7.82±1.81 7.68±1.88

表4 各组不同时期SDF-1蛋白荧光强度的表达( s，n=8)

表4 各组不同时期SDF-1蛋白荧光强度的表达( s，n=8)

1 d 7 d 14 d 28 d试验组10.88±0.041)12.85±0.051)10.46±0.131)9.62±0.061)组别对照组2.14±0.03 2.04±0.05 2.12±0.03 2.11±0.05

2.4 激光共聚焦检测蛋白表达变化 两组心肌组织均有SDF-1和CXCR4蛋白荧光表达。心肌梗死区域SDF-1、CXCR4表达明显增加，组间比较有显著性差异(P＜0.05)。见表4、表5。免疫激光共聚焦图片可见SDF-1和CXCR4在梗死心肌及局部血管壁上高表达。见图1。

表5 各组不同时期CXCR4蛋白荧光强度的表达( s，n=8)

表5 各组不同时期CXCR4蛋白荧光强度的表达( s，n=8)

1 d 7 d 14 d 28 d试验组 8.80±0.141)11.48±0.271) 9.25±0.121) 7.55±0.141)对照组2.05±0.05 2.16±0.04 2.13±0.03 1.95±0.06组别

图1 心肌梗死后7 d组织及血管壁上SDF-1/CXCR4表达情况(×200)

3 讨论

SDF-1也被称为前B细胞生长刺激因子(PBSF)，是CXC细胞因子亚家族成员之一，由Nagasawa等〔2〕于1996年从骨髓间充质细胞中分离得到。随后研究发现SDF-1在不同动物机体中的胸腺、骨髓、肝脏、心脏及大脑等组织中均有广泛的表达。CXCR4是目前发现的SDF-1唯一的并且具有高度特异性的受体。CXCR4同样表达于多种组织及器官，如:脐血、骨髓、多种非造血细胞以及CD34+细胞表面。

研究发现SDF-1/CXCR4表达变化在组织损伤后修复过程中扮演着重要作用〔3〕。当组织发生损伤后，损伤部位局部组织细胞SDF-1的分泌量增加，进而诱导外周CXCR4+的各类干细胞逆SDF-1浓度梯度向受损部位定向迁移，最终参与受损部位组织的修复和重建。SDF-1还具有促进血管内皮细胞成血管作用，该效应可促进受损组织部位血运重建。研究证明SDF-1是出生后重要的组织修复因子。同时，SDF-1是潜在的干细胞归巢因子，临床上可通过调控SDF-1α的表达释放或外源性应用达到治疗缺血性损伤的目的〔4〕。在心血管疾病研究中发现，SDF-1/CXCR4参与了血管新生等作用。本研究发现正常心肌及心梗后心肌均有SDF-1和CRCX4表达，而心肌梗死可上调SDF-1和CRCX4在损伤心肌局部的表达。

结合现阶段研究报道〔5，6〕与本研究结果，我们推测梗死心肌在局部缺血缺氧等损伤环境条件下SDF-1/CXCR4高表达，随着SDF-1分泌入外周血，骨髓及血中CXCR4+干细胞等具有修复作用的细胞逆SPF-1浓度梯度向心梗区域定向迁徙，当到达心梗区域后与局部组织中高表达SDF-1和CXCR4的血管壁发生特异性结合，进而迁移到受损心肌组织中，促进心梗部位组织的修复及毛细血管新生〔7〕。本实验结果中SD大鼠急性心肌梗死后，SDF-1和CXCR4在梗死区心肌组织的表达随时间变化无显著性差异，可能是因为心梗局部组织缺血缺氧，心肌细胞大量坏死，SDF-1和CXCR4仅能在少量存活组织细胞上高表达，从而限制了其在局部组织中的损伤修复作用。

结合本研究及目前SDF-1/CXCR4在损伤后修复中所起作用的研究进展，我们有理由相信在将来的研究中可通过调控心梗局部SDF-1和CXCR4的表达获得改善心梗后心脏功能的治疗目的。

1 孙敬方.动物实验方法学〔M〕.北京:人民卫生出版社，2001:369.

2 Nagasawa T，Nakajima T，Tachibana K，et al.Molecular cloning and characterization of a murine pre-B-cell growth-stimulating factor/stromal cellderived factor 1 receptor，a murine homolog of the human immunodeficiency virus 1 entry coreceptor fusin〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1996;93:14726-9.

3 Lee MS，Lill M，Makkar RR.Stem cell transplantation in myocardial infarction〔J〕.Rev Cardiovasc Med，2004;5(1):82-98.

4 Mirshahi F，Pourtau J，Li H，et al.SDF-1 activity on microvascular endothelial cells;consequences on angiogenesis in vitro and in vivo models〔J〕.Thromb Res，2000;99(6):587-94.

5 Askari AT，Unzek S，Popovic ZB，et al.Effect of stromal-cell-derived factor 1 on stem-cell homing and tissue regeneration in ischaemic cardiomyopathy〔J〕.Lancet，2003;362(5):697-703.

6 Lafamma MA，Murry CE.Regenerating the heart〔J〕.Nat Biotechnol，2005;23(7):845-56.

7 Bartunek J，Wijns W，Heyndrickx GR.Timing of intracoronary bone-marrow-derived stem cell transplantation after ST elevation myocardial infarction〔J〕.Nat Clin Pract Cardiovasc Med，2006;3:S52-S56.