灯盏花素对缺血再灌注大鼠心肌Caspase-9蛋白及mRNA表达的影响

龚明玉 杜 超 苏 玲 (承德医学院生化教研室，河北 承德 067000)

研究发现，细胞凋亡可能为缺血再灌注(IR)损伤发病机制中的一个重要环节〔1，2〕。Caspase-9是参与调节和执行凋亡内源性途径最重要的蛋白酶之一，抑制其活性可以减少凋亡发生。灯盏花素(Bre)是从灯盏花中提取的黄酮类成分，临床上主要用于治疗心、脑血管等疾病，疗效确切。但目前关于该药治疗缺血性心脏病确切机制尚不清楚。本研究从心肌Caspase-9蛋白及其mRNA的变化角度探讨Bre对IR大鼠心肌的影响机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 Bre注射液(吉林龙泰制药股份有限公司);TRIZOL Reagent(Invitrogen)、RT-PCR 试剂盒、DNA Marker(上海生工);Caspase-9兔抗鼠多克隆抗体(美国Santa公司);其他常用试剂均为国产市售分析纯。

1.2 动物 健康SD大鼠40只，体重(220±20)g，雌雄各半。天津市山川红实验动物科技有限公司，许可证号scxk津2009-001。

1.3 主要仪器 DB-3型心电图机(上海光电医用电子仪器有限公司);DW-2000型动物人工呼吸机(上海嘉鹏科技有限公司);凝胶扫描定量采用美国Alpha公司的ChemilmagerTM5500凝胶成像系统。

1.4 实验动物的分组及处理 40只SD大鼠随机分为4组:假手术组、模型组、BreⅠ组和BreⅡ组，每组10只。4组大鼠均制备心肌IR模型，其中Bre组大鼠于手术前1 w分别腹腔注射不同剂量的Bre(25、50 mg·kg-1·d-1)，连用7 d;假手术组和模型组术前分别给予相应容积的生理盐水，时间同Bre组。

1.5 心肌IR模型的制备 10%乌拉坦腹腔注射麻醉(1 ml/100 g)大鼠，仰卧位固定，用针型电极插入大鼠四肢皮下记录标准肢体Ⅱ导联心电图。于胸骨左缘3～4肋间切开胸壁，暴露心脏，在左心耳与肺动脉干之间结扎左冠状动脉前降支，同时在结扎线与血管之间穿一直径2 mm，长5 mm的硅胶管，结扎30 min;然后剪断缝合线，取出硅胶管，再灌注2 h，假手术组仅分离前降支，但不结扎。以结扎后心电图ST段明显抬高，结扎线远端心肌颜色先变白后变暗为心肌缺血成功标志，缺血30 min后，松开结扎线 ，缺血区心肌变红 ，抬高的ST段回落为再灌注成功标志。

1.6 心肌梗死面积检测 再灌注2 h后，立即剪取心脏，生理盐水冲洗干净，去除心房和右心室，垂直于心脏长轴连续做6个切片，立即将切片置于37℃，1.5%氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸盐缓冲液中避光孵育30 min，染色后用4%甲醛固定24 h。经TTC染色后，可见存活的心肌被染为深红色，梗死心肌呈灰白色，然后剪取梗死区苍白区与非梗死区红染区 ，吸干水分，称重，计算梗死心肌面积(IS)占心室面积百分比。心肌梗死面积(IS)=苍白色/(红色+苍白色)×100%。

1.7 Western印迹检测大鼠心肌组织Caspase-9蛋白水平 心肌组织蛋白提取，称取心肌组织约100 mg，加入冰预冷的适量细胞裂解液，制成心肌细胞匀浆。冰上裂解40 min，4℃，12 000 r/min，离心20 min，收集上清，按照BCA蛋白定量试剂盒说明进行蛋白定量测定。采用Western印迹法检测Caspase-9蛋白的表达，上样量80 μg，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜上;一抗稀释浓度1∶100，ECL检测试剂盒显影，洗片。以β-actin(1∶200稀释)杂交作为内对照。胶片经扫描仪扫描后获得图像。用Bandleader3.0软件进行灰度分析，计算目的蛋白条带与β-actin的灰度比值。

1.8 RT-PCR测定Caspase-9 mRNA的表达 实验结束时各组取缺血再灌注区心肌组织100 mg，应用TRIZOL Reagent提取心肌组织总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度，1%琼脂糖凝胶电泳分析其完整性。取5 μg RNA在逆转录酶M-MLV催化下合成cDNA，以适量cDNA为模板进行PCR反应。Caspase-9基因引物序列为上游5'-ATGCTGTCCCATACCAGG-3'，下游 5'-CAGGAACCGCTCTTCTTGT-3';β-actin 基因引物序列为上游5'CTGAGAGGGAAATCGTGCGT3'，下游5'TGGAAGGTGGACAGTGAGGC3';其扩增产物长度依次为142 bp，448 bp。PCR 反应体系 20 μl。Caspase-9PCR 反应条件:95℃3 min，94℃40 s ，56℃ 40 s，72℃ 30 s，72℃ 10 min，扩增 30 个循环;内参照 β-actin PCR反应条件:95℃ 3 min，94℃ 40 s，54℃ 40 s，72℃ 1 min，72℃ 3 min，扩增30个循环。将产物于2%琼脂糖凝胶电泳，恒压120 V，30 min，UVP成像分析系统拍照观察。用Quantity One软件进行灰度分析，计算目的基因条带与内参照 (β-actin)的灰度比值即为Caspase-9基因mRNA的相对表达量。反应结束后取5 μl扩增产物，用2%琼脂糖对每个PCR产物进行电泳，在凝胶成像仪上进行扫描及定量分析。测目的基因与β-actin的RT-PCR产物电泳带的灰度比值，即为目的基因Caspase-9 mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 Bre对大鼠心肌梗死范围的影响 通过 TTC染色，检测缺血30 min再灌注2 h大鼠心脏的梗死面积发现，假手术组未发现梗死，模型组心肌梗死明显(39.64±1.68)，BreⅠ组和BreⅡ组心肌梗死面积(37.59±1.26，35.98±1.47)明显小于模型组(P＜0.01)。说明Bre使IR心肌损伤减轻，缩小梗死面积，并存在一定的量效关系，并且在较大剂量时(50 mg·kg-1·d-1)能发挥较好的保护作用。

2.2 Bre对IR大鼠心肌组织Caspase-9蛋白表达水平的影响Western印迹见图1。与假手术组Caspase-9蛋白表达的灰度值(0.64±0.08)比较，模型组Caspase-9蛋白表达的灰度值(1.85±0.10)明显升高(P＜0.01)，BreⅠ组和 BreⅡ组Caspase-9蛋白表达的灰度值(1.66±0.05，0.80±0.13)较模型组降低(P＜0.05，P＜0.01);BreⅡ组Caspase-9蛋白表达的灰度值较BreⅠ组降低(P＜0.01)。

图1 各组大鼠心肌组织Caspase-9蛋白表达

2.3 Bre对IR大鼠心肌组织Caspase-9mRNA表达水平的影响与假手术组Caspase-9目的基因的表达量(0.61±0.12)比较，模型组Caspase-9目的基因的表达量(1.38±0.11)明显升高(P＜0.01);与模型组比较，BreⅠ组(0.88±0.12)和BreⅡ组(0.64±0.07)Caspase-9目的基因的表达量降低(P＜0.01);BreⅡ组Caspase-9目的基因的表达量较BreⅠ组降低(P＜0.05)。见图2。

图2 各组大鼠心肌组织Caspase-9 mRNA表达

3 讨论

目前，缺血性心脏病是导致人类死亡的主要原因之一，它是由于冠状动脉硬化导致心肌缺血、缺氧造成的。临床研究表明，恢复缺血组织的血液供应即再灌注可以挽救濒死心肌，改善心脏功能。然而，再灌注本身可以导致有害的病理生理学反应，促进细胞死亡即心肌缺血再灌注损伤(MIRI)〔3〕。研究表明，IR时心肌细胞死亡主要表现为坏死和凋亡两种形式。细胞凋亡是一种受基因调控的主动性死亡方式，是受细胞内、外因子调控的生物学过程，表现为凋亡信号通路的启动及相关基因的表达。目前研究发现，天冬氨酸特异的Caspases是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶，凋亡的最后实施是通过Caspases的激活而实现的。目前认为内源性细胞凋亡途径是通过线粒体实现的〔4，5〕。线粒体是对缺血缺氧极其敏感的器官，在某些应激因素下，线粒体膜损伤可致线粒体通透性增高，细胞色素C由线粒体释放出来后，与Apaf-1形成复合体，激活Caspases的启动子，主要是Caspase-9，并进而激活下游Caspase-3，从而启动了Caspase级联反应。Caspase-3的激活可通过裂解DNA依赖性蛋白激酶等，改变其结构，促使细胞凋亡〔6〕。本研究提示Caspase-9参与了再灌注时心肌组织损伤。Bre是从中药灯盏花中提取的黄酮类化合物，现有研究表明〔7，8〕，Bre具有扩张血管和改善微循环，促纤溶等方面的作用;临床上能够抗对脑缺血和心肌缺血，缩小心肌梗死范围，已被应用于心、脑血管疾病的治疗。本实验结果表明，Bre处理后，IR诱导的心肌梗死面积缩小，Caspase-9 mRNA和蛋白表达水平降低。由此推测，Bre对IR损伤心肌的保护作用可能与其抑制Caspase-9 mRNA和蛋白表达，进而抑制线粒体凋亡途径的激活有关。

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5 Galluzzi L，Morselli E，Kepp O，et al.Mitochondrial gateways to cancer〔J〕.Mol Aspects Med，2010;31(1):1-20.

6 Wellington CL，Hayden MR.Caspases and neurodegeneration:on the cutting edge of new therapeutic approaches〔J〕.Clin Genet，2000;57(1):1-10.

7 李 文，范 洁，张 翔，等.灯盏花对急性心肌梗死再灌注治疗后左心功能的影响〔J〕.临床心血管病杂志，2000;16(1):46-7.

8 张晓丹，刘 婧，张伟兵，等.灯盏花素心血管药理及临床研究进展〔J〕.中国药业，2007;16(21):1-5.