结直肠癌组织中Ang-2、Tie-2 mRNA的表达及K-ras基因突变的检测*

王瑞华，谢建国，付 强，谢 天，马 杰，常玉玺

1)上海市奉贤区中心医院消化内科 上海 201499 2)郑州大学附属肿瘤医院普外科 郑州 450008 3)郑州大学附属肿瘤医院病理科 郑州 450008

肿瘤的血管生成受到多种血管生成因子的调控，近年来，越来越多的研究关注促血管生成素家族，尤其促血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)[1]。Ang-2是Tie/angiopoeitin信号通路的一部分，涉及血管的形成和发育。Ang-2及其特异性酪氨酸激酶受体-2(tyrosine kinase receptor-2，Tie-2)是肿瘤血管生成的重要调节因子[2]。Ang-2/Tie-2信号通路激活将导致血管内皮细胞结构不稳定，诱导血管生成[3]。ras基因是最常见的癌基因，它由K-ras、H-ras和N-ras家族组成。研究[4]表明K-ras为大肠癌转化基因，其突变是大肠癌发生发展过程中早期分子事件之一。作者对结直肠癌组织中Ang-2、Tie-2 mRNA的表达及K-ras基因突变进行检测、分析，探讨其在结直肠癌发生发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1组织来源标本来自郑州大学附属肿瘤医院普外科2010年6月至2011年6月经手术切除、病理证实的结直肠腺癌40例，10例正常大肠组织取自切除肠段的断端。其中男21例，女19例，年龄27～78岁。高中分化癌31例，低未分化癌9例；Dukes分期：A期4例，B期19例，C期13例，D期4例；大体类型：隆起型22例，溃疡型16例，浸润型2例；无淋巴结转移21例，有淋巴结转移19例(包括肝转移4例)；浸润深度：浸润至肌层14例，浸润至浆膜层26例。将组织标本装于冻存管中，迅速置于液氮中保存待检。

1.2试剂及仪器oligo-(dT)(TaKaRa D510)，Ribonuclease Inhibitor(TaKaRa D2310A)，M-MLV Reverse Transcriptase(Promega M170A)，RNA抽提试剂盒、BioEasy SYBR Green Ⅰ Real-time PCR试剂盒(北京尚柏生物医学技术有限公司)。其余生化试剂均为进口分析纯。Line-gene 荧光定量PCR检测系统(杭州博日科技有限公司)，DYY-7C型电泳仪及紫外分析仪(北京六一仪器厂)，DYCP-31D型水平式电泳槽(北京宾达英创科技有限公司)。

1.3Ang-2、Tie-2mRNA的检测采用Real-time PCR法。将组织在液氮中磨碎，裂解匀浆处理后，提取总RNA，取3 μL逆转录得cDNA，以此为模板行Real-time PCR。所用引物由北京尚柏生物医学技术有限公司合成，引物序列见表1。反应体系: 2×SYBR Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，蒸馏水20.7 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，cDNA 2 μL。以B2微球蛋白(B2-MG)为内参。反应程序:95 ℃ 120 s；95 ℃ 20 s，59 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，45个循环。记录每个循环反应管中的荧光信号值，并描绘曲线。记录达阈值的最低循环数(Ct值)，以2-ΔΔCt表示目的基因的表达量[5]。

1.4K-ras基因突变的检测采用PCR-SSCP方法。将液氮保存的组织匀浆用蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提，冷无水乙醇沉淀，0.1×TE溶解，置4 ℃冰箱保存备用。K-ras基因PCR引物序列参照文献[2]，由北京尚柏生物医学技术有限公司合成，序列见表2。以GAPDH为内参。PCR反应总体积50 μL，于PCR循环仪94 ℃变性75 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循环35次，最后72 ℃延伸5 min。取PCR产物5 μL与等量加样缓冲液混合，98 ℃变性10 min，冰浴骤冷5 min，然后加样在80 g/L聚丙烯酰胺凝胶上电泳5 h,银染鉴定。

表1 Ang-2、Tie-2及内参PCR引物序列

表2 K-ras及内参PCR引物序列

1.5统计学处理应用SPSS 11.0进行数据分析。正常和癌组织中Ang-2、Tie-2 mRNA表达量的比较，以及K-ras基因突变和未突变癌组织中两者mRNA表达量的比较采用两独立样本的t检验，对癌组织中Ang-2和Tie-2 mRNA表达量行Pearson相关分析，不同临床病理特征的癌组织中Ang-2、Tie-2 mRNA高表达率及K-ras基因突变率的比较采用χ2检验或精确概率法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1结直肠癌组织中Ang-2、Tie-2mRNA的表达

Ang-2、Tie-2 mRNA溶解曲线都为单峰，说明各基因扩增产物纯净，未扩增出非特异性产物。Ang-2、Tie-2 mRNA扩增曲线都呈典型S型，说明各基因产物扩增正常。Ang-2、Tie-2 mRNA在正常组织中的表达量均为1，癌组织中分别为(2.92±0.23)、(2.17±0.15)，均较正常组织明显增高(t=39.960、9.490，P<0.001)。结直肠癌组织中Ang-2 mRNA与Tie-2 mRNA表达量呈线性正相关(r=0.772，P<0.001)。以Ang-2、Tie-2 mRNA表达量高于2.92和2.17为高表达，则两者高表达与结直肠癌临床病理特征的关系见表3。

表3 Ang-2、Tie-2 mRNA高表达与结直肠癌临床病理特征的关系 例(%)

*：校正χ2。

2.2结直肠癌组织中K-ras基因突变检测结果40例结直肠癌组织中K-ras基因突变率为42.5%(17/40)。突变的17例中，11例为12密码子由GGT到GAT突变，6例为13密码子由GGC到GAC突变。不同临床病理特征结直肠癌组织中K-ras基因突变率的比较见表4。

表4 不同临床病理特征结直肠癌组织中K-ras基因突变率的比较

*：精确概率法。

2.3结直肠癌组织中K-ras基因突变与Ang-2、Tie-2mRNA表达的关系见表5。

表5 结直肠癌组织中K-ras基因突变与Ang-2、Tie-2 mRNA表达的关系

3 讨论

Ang-2位于人类染色体的8p23.1，其受体为Tie-2，该受体的磷酸化参与血管生成的延续过程，使血管成熟稳定。有研究[6]表明Ang-2的表达是肿瘤性血管新生起始的强化因素，与肿瘤性血管生成的数目和肿瘤的侵袭转移密切相关。Ang-2与Tie-2受体特异性地结合，可拮抗Ang-1稳定血管结构的作用，消除血管基底膜和周围间质细胞对血管形成的限制，并增加内皮细胞对内皮生长因子等血管增殖因素的敏感性，诱导内皮细胞分裂、萌芽、迁移，从而促进血管生成，血管增生显著，管壁通透性明显增加，继而导致了高度不稳定渗漏性、不成熟性及内皮细胞高度增殖的肿瘤血管持续生成[7]。研究[8]表明，Ang-2是一个独立的指标，可用于临床评价肝细胞癌患者的病情，与肿瘤大小和患者的生存密切相关。有研究[9-12]发现，Ang-2过度表达可导致肺肿瘤不受控制的转移；抑制Ang-2则可减少肿瘤的淋巴结转移和自发性肿瘤的发生；Ang-2是非常有希望的肿瘤治疗靶点。

K-ras基因突变点固定在12、13和61密码子，其中以12位密码子突变最常见。作为一种原癌基因，K-ras基因突变在结直肠细胞癌变的早期即被启动，突变产生具有致癌活性的P21蛋白，通过Ras信号转导通路激活下游信号分子，持续刺激细胞生长、发育、增殖，引起细胞恶变。K-ras基因的激活有多种表现形式，可以是表达增加或是基因突变或是内在的GTP酶活性下降。

该研究结果显示：结直肠癌组织中Ang-2、Tie-2 mRNA的表达明显上调，两者的表达量呈线性正相关，且两者表达量与肿瘤的浸润深度、Dukes分期、淋巴结转移和肿瘤分化程度有关，与Goede等[13]研究结果相同。研究结果还显示，40例结直肠癌组织中K-ras基因突变率为42.5%，K-ras基因突变与性别、肿瘤细胞的浸润深度等无明显相关，但有淋巴结转移者K-ras基因突变率高于无转移者，Dukes分期C、D期者K-ras基因突变率高于A、B期。作者还发现，K-ras基因突变的结直肠癌组织中Ang-2、Tie-2 mRNA表达量高于无突变者，提示K-ras基因突变可能通过促进肿瘤血管的生成，参与了结直肠癌的侵袭、转移。

总之，Ang-2、Tie-2系统在结直肠癌的转移机制和未来的治疗靶点方面值得进一步研究；K-ras基因作为分子生物学指标，对判断结直肠癌转移和预后具有重要意义。

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